Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

Summary

Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.

Abstract

Bestaande protocollen voor het genereren van neuronen uit humane pluripotente stamcellen (hPSCs) zijn vaak vervelend omdat ze meerstaps procedures waarbij de isolatie en expansie van neurale voorlopercellen, voorafgaand aan terminale differentiatie. In vergelijking met deze tijdrovende aanpak, hebben we onlangs ontdekt dat gecombineerde remming van drie signaleringsroutes, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, en FGF / ERK, een snelle inductie van neuroectoderm bevordert van hPSCs, gevolgd door onmiddellijke differentiatie in functionele neuronen. Hier hebben we aangepast onze procedure om een ​​nieuwe multititre plaat formaat, verder zijn reproduceerbaarheid en compatibel te maken met mid-throughput toepassingen. Het omvat vier dagen neuroectoderm vorming in drijvende bollen (embryoid organen), gevolgd door nog eens vier dagen differentiatie tot neuronen onder hechtende omstandigheden. De meeste cellen verkregen met dit protocol lijken bipolaire sensorische neuronen. Bovendiende procedure is zeer efficiënt, geen bijzondere vakkennis, en is gebaseerd op een eenvoudig chemisch gedefinieerd medium met rendabele kleine moleculen. Door deze maatregelen kan de regeling dienen als een nuttig platform voor verder functioneel onderzoek en voor celgebaseerde screening benadert waarbij menselijke sensorische neuronen of neuronen van elk type.

Introduction

hPSCs, omvattende embryo-verkregen embryonale stamcellen (hESC ') en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), pluripotent zijn betekent dat zij aanleiding geven tot verschillende cellijnen in vitro ^1-2. Tal van gedifferentieerde celtypes zijn afgeleid van hESC 's tot nu toe, het ondersteunen van het idee dat deze cellen waardevolle instrumenten voor wetenschappelijk onderzoek en cel-gebaseerde screeningsmethoden te presenteren, en veelbelovend voor cel-gebaseerde therapieën.

Neuronale differentiatie protocollen voor hESC 'zijn meestal complex en tijdrovend omdat ze vaak gebaseerd op de eerste inducerende algemene neurale lot, gevolgd door manuele isolatie van neurale stamcellen en daaropvolgende terminale differentiatie in een bepaalde soort neuron plaats ^3-6. In sommige opzicht deze complexiteit is het niet verwonderlijk en onvermijdelijk gezien het feit dat een dergelijke state-of-the-art gerichte differentiatie protocollen hebben de neiging om stapsgewijs na te bootsen de vroege ontwikkeling van de mens, which is op zichzelf zeer complex. Anderzijds kan het voor een deel ook tijdens ons gebrek aan begrip van de onderliggende moleculaire processen, waardoor differentiatie protocollen die nog verre van volledig geoptimaliseerd.

Met betrekking tot de omzetting van ongedifferentieerde hPSCs in neuroectoderm, Pera et al.. vond dat onderdrukking van BMP / SMAD1/5/8 signalering neurale inductie van hESC 's ⁷ verbetert. Bovendien heeft inactivering van Smad2 / 3 signalering is aangetoond neuroectoderm vorming ⁸ bevorderen. Dienovereenkomstig, in combinatie inactivatie van deze twee wegen heeft de neiging te leiden tot een efficiëntere neurale inductie van hPSCs ^4,9. Meer recent hebben wij aangetoond dat een derde signaalweg, FGF / ERK, dient als een sterke repressor van de eerste stappen van neuroectodermale inzet in hESC '. Omgekeerd gelijktijdige repressie van deze drie routes tot bijna homogene omzetting van hESC 'in neuroectoderm metin slechts vier dagen ^10. Vervolgens werd zeer efficiënte terminale differentiatie in functionele neuronen waargenomen binnen acht dagen. De verkregen neuronen waarschijnlijk sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel, die gedeeltelijk verklaren hun snelle afleiding ^10. Defecten in sensorische neuron onderhoud wordt beschouwd als een oorzaak van bepaalde menselijke aandoeningen zoals familiaire dysautonomia ^11. Voor het modelleren van dergelijke ziekten gebaseerd op technologie hiPSC ¹² voor meer functionele karakterisering, en voor toegepaste doeleinden zonder eigen een bepaald type van neuronen kan deze differentiatie procedure vormen een nuttige basis.

Echter, de differentiatie strategie die we oorspronkelijk betrokken vorming van embryonale organen (EBS) in dienst van de massa's van hESC kolonies ^10, en dit resulteerde in een flink mate van heterogeniteit ten aanzien van EB maten, en verscheen ook tot neuron vorming efficiëntie compromissen in sommige cell lijnen. Bovendien, vanwege de heterogeniteit in afmetingen EB het vermogen om systematisch effect van extra groeifactoren of kleine moleculen tijdens en na testen neuron formatie enigszins worden verward.

In dit verslag wordt aangepast onze vorige procedure om een middelgrote doorvoer compatibel, gedwongen aggregatie gebaseerde techniek aan EBS genereren in een zeer gecontroleerde manier grootte, zoals ook in andere contexten ^13. Vervolgens EBS gegenereerd in V-vormige putjes van platen met 96 putjes werden overgebracht naar U-vormige ultra-laag attachment platen met 96 putjes, tot neuroectoderm vorming in suspensie te leiden. Vier dagen later kan de EBS worden uitgeplaat die tot terminaal gedifferentieerde neuronen bij hoge efficiency en homogeniteit. Alternatief dagen EB-4 werden gedissocieerd in enkele cellen en uitgeplaat als zodanig, waardoor lage dichtheid monolagen van menselijke neuronen. Consistente resultaten werden tot nu toe verkregen met twee onafhankelijk dedan eindelijk zover hESC lijnen, HuES6 en NCL3.

Als een voorwaarde, succesvolle EB formatie was strikt afhankelijk van het gebruik van een synthetisch polymeer, polyvinylalcohol (PVA), samen met ROCK remmer Y-27632 bekend dat hESC overleven ^{13 tot 14} te bevorderen. Dientengevolge homogeniteit van de EBS gevormd in 96-V-platen werd aanzienlijk verbeterd in vergelijking met vorming van EBS als massa kweken gebaseerd op willekeurige splitsing technieken. Dit systeem verschaft dus een sterk verbeterd platform voor neuroectoderm vorming in suspensiekweek, gevolgd door zeer gecontroleerde vorming onder neuron hechtende omstandigheden.

Protocol

1. Bereiding van Matrigel beklede platen en Media Bereiding van Matrigel beklede platen Matrigel is gevonden een voorkeurssubstraat voor het bevestigen differentiëren EVSA zijn en ook stimuleert een efficiënte uitgroei van neuronen van de 10. Thaw 10 ml Matrigel 's nachts op het ijs. Volgende dag verdunnen geleiachtige Matrigel met twee volumes ijskoude DMEM/F-12 en aliquots van 1 ml in 15 ml voorgekoelde conische buizen die kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C. …

Representative Results

In ons vorige rapport, in lijn met vele anderen, kon EVSA's van hPSCs eenvoudig worden gegenereerd door replating aggregaten op routine splitsing van hPSCs in lage-gehechtheid gerechten 10. Dit resulteert meestal in een brede verspreiding van de resulterende EB maten (Figuur 1C, boven). Een ander probleem in verband is dat EBS gesuspendeerd blijven neiging te aggregeren met elkaar, wat leidt tot een nog grotere heterogeniteit van EB afmetingen. Om deze problemen te omzeilen, hebben we dan…

Discussion

De meeste protocollen betreffende differentiatie EB vorming van hPSCs, waaronder onze eerder gepubliceerde procedure ^10, gebaseerd op handmatige of enzym-assisted oogsten van hESC 'als aggregaten, die onvermijdelijk leidt heterogeniteit in afmetingen EB. Dit feit leidt tot variabiliteit in differentiatie efficiëntie sommige cellijnen, waardoor een systematische analyses moeilijk, vooral op een gemiddelde doorvoer schaal. Bovendien handmatige dissectie arbeidsintensief dat zelf compromitteert schaalbaarhe…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	See text for details on handling
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poly(vinyl alcohol)	Sigma	363170	Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048	100X, store as frozen aliquots
B27 Supplement	Life Technologies	12587-010	50X, store as frozen aliquots
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1595	10% = 500X, store as frozen aliquots
L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin	PAA	P11-013	Or equivalent
FGF2	Peprotech	100-18B	Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots
ROCK inhibitor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
PBS	PAA	H15-002	Or equivalent
Accutase	PAA	L11-007
96-well V-bottom plates	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
96-well U-bottom ultra-low attachment plates	Corning	7007
beta-III Tubulin antibody (mouse)	Sigma	T8660	use at 1:1000
beta-III Tubulin antibody (rabbit)	Covance	PRB-435P	use at 1:2000
BRN3A (POU4F1) antibody	Santa Cruz	sc-8429	use at 1:500
			Table 1. Specific reagents and equipment.