Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre
Summary
Les protocoles de différenciation neuronale des cellules souches humaines pluripotentes (hPSCs) sont souvent beaucoup de temps et nécessitera d'importantes compétences de culture cellulaire. Ici, nous avons adapté une procédure de différenciation petite molécule à base d'un format de plaque multititre, permettant la génération simple, rapide et efficace des neurones humains d'une manière contrôlée.
Abstract
Protocoles existants pour la génération de neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont souvent fastidieux en ce que ce sont des procédures en plusieurs étapes impliquant l'isolement et l'expansion de cellules précurseurs neurales, avant la différenciation terminale. Par rapport à ces approches consommatrices de temps, nous avons récemment découvert que l'inhibition combinée de trois voies de signalisation, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 et FGF / ERK, favorise l'induction rapide de neuroectoderme de hPSCs, suivie par la différenciation en neurones fonctionnels immédiate. Ici, nous avons adapté notre méthode à un format multititre nouvelle plaque, afin de renforcer sa reproductibilité et de la rendre compatible avec la mi-débit des applications. Il comprend quatre jours de formation neuroectoderme dans les sphères flottantes (corps embryoïdes), suivis par quatre autres jours de différenciation en neurones dans des conditions d'adhérence. La plupart des cellules obtenues avec ce protocole semble être neurones sensoriels bipolaires. En outre,la procédure est très efficace, ne nécessite pas de compétences particulières experts, et est basé sur un simple support chimiquement défini avec rapport coût-efficacité des petites molécules. Grâce à ces caractéristiques, la procédure peut servir de plate-forme utile pour exploration fonctionnelle continue ainsi que pour le criblage cellulaire s'approche nécessitant des neurones sensoriels de l'homme ou des neurones de n'importe quel type.
Introduction
hPSCs, comprenant l'embryon issu cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs), sont pluripotentes sens qu'ils peuvent donner lieu à diverses lignées cellulaires in vitro 1-2. De nombreux types de cellules différenciées ont été dérivées de CSEh à ce jour, en soutenant l'idée que ces cellules présentent des outils précieux pour la recherche scientifique et des approches de dépistage basés sur les cellules, et sont prometteuses pour des traitements à base de cellules.
Protocoles de différenciation neuronale des CSEh sont généralement complexes et de longue haleine car ils sont souvent basées sur l'ensemble induisant sort premier de neurones, suivie de l'isolement manuel des progéniteurs neuronaux, et la différenciation terminale ultérieure dans un type de neurone d'intérêt donné 3-6. À certains égards, cette complexité n'est pas surprenant et inévitable, étant donné qu'un tel état-of-the-art des protocoles de différenciation dirigés ont tendance à imiter les étapes de développement du jeune homme, which est en soi extrêmement complexe. D'un autre côté, il peut aussi en partie le reflet de notre manque de compréhension des processus moléculaires sous-jacents, résultant dans des protocoles de différenciation qui sont encore loin d'être pleinement optimisée.
En ce qui concerne la conversion de hPSCs indifférenciées en neuroectoderme, Pera et al. constaté que la suppression de BMP / SMAD1/5/8 signalisation améliore l'induction neurale de hESC 7. De plus, l'inactivation de SMAD2 / 3 de signalisation a été montré pour favoriser 8 Formation neuroectoderme. Par conséquent, l'inactivation combinée de ces deux voies a tendance à conduire à l'induction neurale plus efficace des hPSCs 4,9. Plus récemment, nous avons montré que la voie de signalisation troisième FGF / ERK, sert de répresseur forte des premières étapes de l'engagement neuroectodermique dans les CSEh. En revanche, la répression simultanée de ces trois voies mènent à la quasi-homogène de conversion des CSEh dans neuroectoderme avecen seulement quatre jours 10. Par la suite, la différenciation terminale très efficace en neurones fonctionnels a été observée dans les huit jours. Les neurones obtenus sont susceptibles d'être neurones sensoriels du système nerveux périphérique, ce qui peut en partie expliquer leur calcul rapide 10. Les défauts de l'entretien neurone sensoriel est considéré une des causes de certaines maladies humaines telles que la dysautonomie familiale 11. Pour modéliser ces maladies sur la base de la technologie hiPSC 12, pour la caractérisation fonctionnelle supplémentaire, ainsi que des fins appliquées ne nécessitant pas un type particulier de neurones, cette procédure différenciation peut présenter une base utile.
Cependant, la stratégie de différenciation nous avions utilisé la formation impliqués des corps embryonnaires (EB) à partir de touffes de 10 colonies de CSEh, et cela s'est traduit par un bon degré d'hétérogénéité concernant la taille des EB, et semblait aussi compromettre l'efficacité de formation des neurones dans certaines CElignes ll. En outre, en raison de l'hétérogénéité des tailles EB, la capacité de tester systématiquement les effets des facteurs de croissance ou de petites molécules pendant et après la formation des neurones semblent être quelque peu confus.
Dans ce rapport, nous avons adapté notre procédure précédente pour un support débit compatible, forcé d'agrégation basée technique pour générer EB dans un environnement hautement taille manière contrôlée, comme le montre également dans d'autres contextes 13. Par la suite, l'EB généré en forme de V des puits de plaques 96 puits ont été transférés à U ultra-faible attachement plaques à 96 puits, pour initier la formation neuroectoderme en suspension. Quatre jours plus tard, l'EB pourraient être étalées donnant naissance à des neurones définitivement différenciées à haute efficacité et l'homogénéité. Sinon, le jour EB-4 ont été dissociées en cellules individuelles et étalées en tant que telle, qui a abouti à faible densité monocouches de neurones humains. Des résultats cohérents ont été obtenus jusqu'à présent avec deux indépendamment delignées de CSEh rived, HuES6 et NCl3.
Comme condition préalable, la formation EB succès était strictement dépendante de l'utilisation d'un polymère synthétique, l'alcool polyvinylique (PVA), avec inhibiteur de ROCK Y-27632 connue pour favoriser la survie de 13-14 CSEh. En conséquence, l'homogénéité de l'EB formé en 96-V-plaques a été considérablement améliorée par rapport à la formation d'EB en tant que cultures de masse basés sur des techniques de fractionnement aléatoires. Ce système offre ainsi une plate-forme nettement améliorée pour la formation neuroectoderme en culture en suspension, suivie de la formation des neurones hautement contrôlé dans des conditions d'adhérence.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plupart des protocoles de différenciation impliquant la formation EB à partir hPSCs, y compris notre procédure déjà publié 10, sont basées sur manuel ou assisté par une enzyme de récolte des CSEh sous forme d'agrégats, ce qui conduit inévitablement à l'hétérogénéité des tailles EB. Ce fait conduit à la variabilité de l'efficacité différentiation avec certaines lignées cellulaires, ce qui rend difficile l'analyse systématique, en particulier à l'échelle de débit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Société Max Planck.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
Riferimenti
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