Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Summary

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Abstract

Os protocolos existentes para a produção de neurónios de células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) são muitas vezes entediantes em que se trate de processos com vários passos, envolvendo o isolamento e expansão de células precursoras neurais, antes da diferenciação terminal. Em comparação com estas abordagens demorados, que têm encontrado recentemente que a inibição combinada de três vias de sinalização, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promove a rápida indução de neuroectoderme de hPSCs, seguido de imediato de diferenciação em neurónios funcionais. Aqui, nós adaptamos o nosso procedimento para um formato de romance placa multititre, para aumentar ainda mais a sua reprodutibilidade e para torná-lo compatível com o meio-throughput de aplicativos. Ele compreende quatro dias de formação neuroectoderme em esferas flutuantes (corpos embrióides), seguido por mais quatro dias de diferenciação em neurónios em condições de aderência. A maioria das células obtidas com este protocolo parecem ser os neurônios sensoriais bipolares. Além disso,o processo é altamente eficiente, não requer conhecimentos especializados particulares, e baseia-se em um meio simples quimicamente definido, com boa relação custo-eficiência moléculas pequenas. Devido a estas características, o procedimento pode servir como uma plataforma útil para investigação funcional adicional, bem como para a célula baseada em triagem aproxima exigindo humanos neurónios sensoriais ou neurónios de qualquer tipo.

Introduction

hPSCs, compreendendo embrião derivado de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), são pluripotentes sentido de que eles podem dar origem a linhagens de células diferentes in vitro ^1-2. Vários tipos de células diferenciadas foram derivados de hESCs até à data, apoiar a noção de que essas células apresentam ferramentas valiosas para a pesquisa científica e as abordagens baseadas em células de triagem, e uma promessa para a célula-base terapêutica.

Protocolos para a diferenciação neuronal hESCs são geralmente complexo e demorado uma vez que são muitas vezes baseados na primeira indução destino global neural, seguido por isolamento manual das células progenitoras neurais, e subsequente diferenciação terminal em um tipo de dado de interesse neurónio ^3-6. Em alguns respeito, essa complexidade não é surpreendente e inevitável, dado que tal estado-da-arte protocolos de diferenciação direcionadas tendem a imitar gradual desenvolvimento humano precoce, which é em si extremamente complexo. Por outro lado, pode, em parte, também reflectem a falta de compreensão dos processos moleculares subjacentes, o que resulta em protocolos de diferenciação que ainda estão longe de ser totalmente otimizado.

No que se refere à conversão de hPSCs indiferenciadas em neuroectoderme, Pera et al. descobriu que a supressão de BMP / SMAD1/5/8 sinalização aumenta a indução neural de hESCs ^7. Além disso, a inactivação de Smad2 / 3 de sinalização tem sido mostrado para promover a formação de neuroectoderme ^8. Por conseguinte, a inactivação combinado destas duas vias tende a levar a mais eficiente de indução neural hPSCs ^4,9. Mais recentemente, têm demonstrado que a via de sinalização do terceiro, FGF / ERK, serve como um repressor forte dos primeiros passos de compromisso neuroectodérmica em hESCs. Inversamente, a repressão simultânea de todos estes três vias levam a quase homogénea conversão de hESCs em neuroectoderme comem apenas quatro dias ^10. Posteriormente, a diferenciação terminal altamente eficiente em neurônios funcionais foi observado no prazo de oito dias. Os neurônios obtidos eram susceptíveis de ser neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico, o que pode, em parte, explicar a sua derivação rápida ^10. Defeitos na manutenção neurônio sensorial é considerada uma causa de certas doenças humanas, tais como disautonomia familiar ^11. Para a modelagem de tais doenças baseadas em tecnologia hiPSC ^12, para a caracterização funcional adicional, bem como para fins de aplicação não exigem qualquer tipo específico de neurónios, este processo de diferenciação podem apresentar uma base útil.

No entanto, a estratégia de diferenciação que originalmente empregado envolvido formação de corpos embrionárias (EBS) de touceiras de colônias CTEh ^10, e isso resultou em um bom grau de heterogeneidade em relação a tamanhos EB, e também apareceu para comprometer neurônio eficiência de formação em algumas celinhas ll. Por outro lado, devido à heterogeneidade nos tamanhos EB, a capacidade para testar sistematicamente os efeitos de factores de crescimento adicionais ou pequenas moléculas, durante e depois da formação de neurónios parecia ser um pouco confusa.

Neste relatório, nós adaptamos o nosso procedimento anterior para um meio de rendimento compatível, forçado técnica de agregação baseado gerar EBs de uma forma altamente tamanho controlado, como também mostrado em outros contextos ^13. Subsequentemente, o EBs gerada em forma de V poços de placas de 96 poços foram transferidas para fixação em forma de U de ultra-baixo de 96 poços, para iniciar a formação de neuroectoderme em suspensão. Quatro dias mais tarde, o EBs pode ser plaqueada para fora dando origem a neurónios terminalmente diferenciadas em alto rendimento e homogeneidade. Alternativamente, 4 dias de EBs foram dissociadas em células isoladas e plaqueadas como tal, o que resultou em baixa densidade monocamadas de neurônios humanos. Os resultados foram coerentes até agora obtida com os dois independentemente deRIVED linhas CTEh, HuES6 e NCl3.

Como pré-requisito, a formação de EB sucesso era estritamente dependente da utilização de um polímero sintético, álcool polivinílico (PVA), em conjunto com o inibidor ROCHA Y-27632 conhecido para promover a sobrevivência hESC ^13-14. Como resultado, a homogeneidade da EBs formado em 96-V-placas foi substancialmente melhorada em comparação com a formação de EBs como culturas em massa com base em técnicas de separação aleatórios. Este sistema proporciona assim uma plataforma significativamente melhorada para a formação de neuroectoderme em cultura em suspensão, seguindo-se a formação de neurónios em condições altamente controlado aderentes.

Protocol

1. Preparação de Matrigel revestidos Pratos e Mídia Preparação de Matrigel revestido Matrigel placas foi encontrado para ser um substrato preferido para a ligação de diferenciação EBs e também promove o crescimento eficiente dos neurónios a partir destes 10. Ml degelo 10 de Matrigel durante a noite em gelo. No dia seguinte, diluir a Matrigel gelatinosa com dois volumes de gelado DMEM/F-12 e preparar alíquotas de 1 ml em 15 ml previamente arrefecido de tubos cónicos q…

Representative Results

Em nosso relatório anterior, em linha com muitos outros, a partir de EBs hPSCs poderiam ser gerados pela simples repique agregados, com a divisão de rotina de hPSCs em fixação de baixa pratos 10. Isso geralmente resulta em uma ampla distribuição de tamanhos EB resultantes (Figura 1C, superior). Outro problema resultante da presente é a de que EBs mantidas em suspensão tendem a agregar uma com a outra, conduzindo a uma ainda maior heterogeneidade de tamanhos de EB. Para contornar esses…

Discussion

A maioria dos protocolos de diferenciação que envolvem a formação de EB hPSCs, incluindo o nosso procedimento publicado anteriormente ^10, baseiam-se manual ou enzima-assisted colheita de hESCs como agregados, o que conduz inevitavelmente a heterogeneidade nos tamanhos de EB. Este fato leva à variabilidade na eficiência de diferenciação com algumas linhas de células, tornando análises sistemáticas difícil, em particular, em uma escala rendimento médio. Além disso, o esvaziamento manual é de trab…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	See text for details on handling
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poly(vinyl alcohol)	Sigma	363170	Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048	100X, store as frozen aliquots
B27 Supplement	Life Technologies	12587-010	50X, store as frozen aliquots
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1595	10% = 500X, store as frozen aliquots
L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin	PAA	P11-013	Or equivalent
FGF2	Peprotech	100-18B	Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots
ROCK inhibitor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
PBS	PAA	H15-002	Or equivalent
Accutase	PAA	L11-007
96-well V-bottom plates	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
96-well U-bottom ultra-low attachment plates	Corning	7007
beta-III Tubulin antibody (mouse)	Sigma	T8660	use at 1:1000
beta-III Tubulin antibody (rabbit)	Covance	PRB-435P	use at 1:2000
BRN3A (POU4F1) antibody	Santa Cruz	sc-8429	use at 1:500
			Table 1. Specific reagents and equipment.