Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre
Summary
Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.
Abstract
Los protocolos existentes para la generación de neuronas a partir de células madre pluripotentes (hPSCs) suele ser tedioso, ya que son procedimientos de múltiples etapas que implica el aislamiento y la expansión de las células precursoras neurales, antes de la diferenciación terminal. En comparación con estos métodos consumen mucho tiempo, recientemente se ha encontrado que la inhibición combinada de tres vías de señalización, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF y / ERK, promueve la rápida inducción de la neuroectodermo de hPSCs, seguido de inmediato diferenciación en neuronas funcionales. Aquí, hemos adaptado nuestro procedimiento para un formato de placa novela multititre, para mejorar aún más su reproducibilidad y para que sea compatible con mediados de rendimiento de las aplicaciones. Se compone de cuatro días de formación neuroectodermo en esferas flotantes (cuerpos embrioides), seguido por un período de cuatro días de diferenciación en neuronas en condiciones adherentes. La mayoría de las células obtenidas con este protocolo parecen ser las neuronas sensoriales bipolares. Por otra parte,el procedimiento es altamente eficaz, no requiere habilidades particulares de expertos, y se basa en un simple medio químicamente definido con rentables moléculas pequeñas. Debido a estas características, el procedimiento puede servir como una plataforma útil para la investigación funcional adicional, así como para el cribado basado en células humanas se aproxima requiere neuronas sensoriales o neuronas de cualquier tipo.
Introduction
hPSCs, que comprende embrión derivado de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son pluripotentes sentido de que pueden dar lugar a diversos linajes celulares in vitro 1-2. Numerosos tipos de células diferenciadas se han derivado de hESCs hasta la fecha, apoyando la idea de que estas células presentan valiosas herramientas para la investigación científica y basados en células enfoques de cribado, y mantienen la promesa para células basadas en la terapéutica.
Protocolos de diferenciación neuronal para hESCs son generalmente complejas y requiere mucho tiempo, ya que a menudo se basan en la inducción de primera general destino neural, seguido de aislamiento manual de los progenitores neuronales, y la diferenciación terminal posterior en un tipo de neurona dada de interés 3-6. En algunos respecto, esta complejidad no es sorprendente e inevitable dado que tal estado-de-la-arte dirigido protocolos de diferenciación por etapas tienden a imitar el desarrollo temprano humano, which es en sí mismo muy complejo. Por otra parte, puede, en parte, también reflejan la falta de entendimiento de los procesos moleculares subyacentes, lo que resulta en protocolos de diferenciación que aún están lejos de ser totalmente optimizado.
Con respecto a la conversión de hPSCs indiferenciadas en neuroectodermo, Pera et al. encontraron que la supresión de BMP / SMAD1/5/8 señalización aumenta la inducción neural de hESCs 7. Además, la inactivación de Smad2 / 3 de señalización se ha demostrado para promover la formación neuroectodermo 8. Por consiguiente, la inactivación combinada de estas dos vías tiende a conducir a la inducción neural más eficiente de hPSCs 4,9. Más recientemente, se ha demostrado que una tercera vía de señalización, FGF / ERK, sirve como un represor fuerte de los primeros pasos de compromiso neuroectodérmico en hESCs. Por el contrario, la represión simultánea de estos tres caminos conducen a casi homogéneo conversión de hESCs en neuroectodermo conen tan sólo cuatro días 10. Posteriormente, la diferenciación terminal altamente eficiente en neuronas funcionales se observó dentro de ocho días. Las neuronas obtenidas fueron probablemente las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico, lo que puede explicar en parte su derivación rápida 10. Errores de mantenimiento neurona sensorial se considera una causa de ciertos trastornos humanos, tales como la disautonomía familiar 11. Para el modelado de dichas enfermedades basadas en la tecnología hiPSC 12, para la caracterización funcional adicional, así como para fines aplicados no requieren ningún tipo particular de neuronas, este procedimiento de diferenciación puede presentar una base útil.
Sin embargo, la estrategia de diferenciación de lo que originalmente se empleó la formación de los cuerpos involucrados embrionarias (EBS) de grupos de 10 colonias hESC, y esto dio lugar a un buen grado de heterogeneidad en cuanto a tamaños de EB, y también parecía poner en peligro la eficiencia de formación de neuronas en algunas celíneas ll. Además, debido a la heterogeneidad en los tamaños EB, la capacidad para probar sistemáticamente los efectos de factores de crecimiento adicionales o moléculas pequeñas durante y después de la formación de neuronas parecían ser algo confundido.
En este informe, hemos adaptado nuestro procedimiento anterior para un rendimiento medio-compatible, forzado agregación basado en la técnica para generar EBS en un tamaño muy controlado de manera que también se observan en otros contextos 13. Posteriormente, el EBS generada en forma de V pocillos de placas de 96 pocillos se transfirieron a en forma de U ultra-bajo fijación placas 96-pocillos, para iniciar la formación neuroectodermo en suspensión. Cuatro días más tarde, el EBS se podría sembraron dar lugar a neuronas terminalmente diferenciadas con alta eficiencia y homogeneidad. Alternativamente, día-4 EBS se disocia en células individuales y se colocaron como tal, lo que resultó en monocapas de baja densidad de neuronas humanas. Resultados fueron coherentes con los obtenidos hasta el momento dos de forma independientelíneas de células madre, Rived HuES6 y NCl3.
Como un requisito previo, la formación de EB éxito era estrictamente dependiente de la utilización de un polímero sintético, alcohol de polivinilo (PVA), junto con inhibidor de la ROCA Y-27632 conocido para promover la supervivencia hESC 13-14. Como resultado de ello, la homogeneidad de la EBS formado en el 96-V-placas se mejoró considerablemente en comparación a la formación de EBs como cultivos en masa basado en técnicas de splitting aleatorios. Así, este sistema proporciona una plataforma significativamente mejorada para la formación de neuroectodermo en cultivo en suspensión, seguido por la formación de neuronas altamente controlada en condiciones adherentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mayoría de los protocolos de diferenciación que implican la formación de EB hPSCs, incluyendo nuestro procedimiento previamente publicado 10, se basa en el manual o con ayuda de enzima de recolección hESCs como agregados, lo que inevitablemente conduce a la heterogeneidad en los tamaños de EB. Este hecho conduce a variabilidad en la eficacia con la diferenciación de algunas líneas celulares, haciendo así difícil análisis sistemáticos, en particular, a una escala de rendimiento medio. Además, la…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Sociedad Max Planck.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
Riferimenti
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