Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim
Summary
Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.
Abstract
Insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) gelen nöronların nesil için mevcut protokoller genellikle önceden terminal farklılaşma için nöral prekürsör hücrelerinin izolasyonu ve genişleme içeren çok adımlı prosedürler vardır bunda sıkıcı vardır. Bu zaman alıcı bir yaklaşım ile karşılaştırıldığında, son zamanlarda üç sinyalleme yolları, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF ve / ERK, kombine inhibisyonu fonksiyonel nöron içine hemen fark ardından hPSCs gelen nöroektodermin hızlı bir indüksiyon teşvik olduğunu bulduk. Burada, biz daha da tekrarlanabilirlik geliştirmek ve orta hacimli uygulamalar ile uyumlu hale getirmek için, bir roman multititre plaka formatı bizim prosedürü adapte etmişlerdir. Yapışık koşullar altında nöronlara geri farklılaşma bir başka dört gün ardından yüzer küreler (embriyoid gövdeler), oluşum içinde nöroektodermin dört gün kapsamaktadır. Bu protokol ile elde Hücrelerin çoğu bipolar duyusal nöronlar görünmektedir. Ayrıca,prosedürü, yüksek verimli olup özellikle uzman beceri gerektirmez, ve maliyet-etkin küçük moleküllerin basit bir kimyasal yapısı orta dayanmaktadır. Bu özellikleri sayesinde, işlem daha fazla fonksiyonel inceleme için yararlı bir platform olarak hem de hücre-bazlı tarama insan duyu nöronlarının veya herhangi bir tür nöronlar gerektiren yaklaşımlar için de kullanılabilir.
Introduction
hPSCs, oluşan embriyo kökenli insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs), onlar vitro 1-2 çeşitli hücre soylarının ortaya çıkmasına neden olabilir pluripotent anlamı vardır. Çok sayıda farklı hücre tipleri bu hücrelerin bilimsel araştırma ve hücre tabanlı tarama yaklaşımlar için değerli araçlar sunmak, ve hücre tabanlı tedavi için ümit vaat fikrini destekleyen güncel hESC elde edilmiştir.
Genellikle ilgi 3-6 belirli bir nöron tipi içine nöral progenitörlerinin manuel izolasyon ve sonraki terminal farklılaşma ardından ilk uyaran genel nöral kaderi esas olarak hESC için nöronal farklılaşma protokoller genellikle karmaşık ve zaman alıcıdır. Bazı bağlamda, bu karmaşıklığı erken insan gelişimi, hangi mimik gibi state-of-the-art yönettiği farklılaşma mekanizmalarının aşamalı eğilimi göz önüne alındığında şaşırtıcı ve kaçınılmaz değildirh kendi içinde son derece karmaşık. Diğer yandan, kısmen de uzak tam olarak optimize edilmesini hala farklılaşma protokolleri ile sonuçlanan, altta yatan moleküler süreçleri anlama eksikliği bizim yansıtıyor olabilir.
Nöroektodermin Pera, et al farklılaşmamış hPSCs dönüşüm ile ilgili olarak. BMP / SMAD1/5/8 sinyalizasyon bastırılması hESC 7 nöral indüksiyonu arttırdığını buldu. Ayrıca, Smad2 / 3 sinyal inaktivasyonu nöroektodermin oluşumunu teşvik etmek için 8 gösterilmiştir. Buna göre, bu iki yolun kombine inaktivasyonu hPSCs 4,9 arasında daha verimli sinir indüksiyonuna yol açma eğilimindedir. Daha yakın zamanlarda, biz üçüncü bir sinyal yolağı, FGF / ERK, hESC içinde nöroektodermal taahhüdü ilk adımları güçlü bir baskılayıcı olarak hizmet verdiğini göstermiştir. Tersine, tüm bu üç yollarının eş zamanlı baskı ile nöroektodermin içine hESC yakın homojen dönüşüm yol10 sadece dört gün içinde. Akabinde, fonksiyonel nöronlar içine yüksek verimli terminal farklılaşma sekiz gün içinde gözlenmiştir. Elde nöronlar kısmen onların hızlı derivasyon 10 açıklayabilir periferik sinir sistemi, duyu nöronlar olması olasılığı vardı. Duyusal nöron bakım Kusur gibi ailesel disotonomi 11 gibi bazı insan hastalıkları nedeni kabul edilir. Bu gibi başka fonksiyonel karakterizasyonu için hiPSC teknolojisi 12 dayalı hastalıklar, nöron de herhangi bir özel tür istenmediğinde uygulamalı amaçlı olarak modellenmesi için, bu işlem yararlı bir türev olarak mevcut olabilir.
Ancak, farklılaşma biz aslında hESC koloniler 10 kümeleri gelen embriyonik organları dahil oluşumu (EBS) istihdam stratejisi ve bu EB boyutları ile ilgili heterojenlik oldukça derecesi sonuçlandı, ve ayrıca bazı ce nöron oluşumunu verimliliğini tehlikeye çıktıll hatları. Ayrıca, EB boyutlarda heterojenliği nedeniyle, sistematik nöron oluşumu sırasında ve sonrasında ek büyüme faktörleri veya küçük moleküllerin etkilerini test etme olanağı biraz şaşırmış göründü.
Bu yazıda, aynı zamanda diğer bağlamlarda 13'te gösterilen, son derece boyutu-kontrollü bir şekilde EBS oluşturmak için bir orta throughput uyumlu, zorla kümeleme tabanlı tekniği bizim önceki yordamı uyarlanmıştır. Daha sonra, süspansiyon EBS olarak nöroektodermin oluşumunu başlatmak üzere, 96-oyuklu plakalar V-şekilli U şeklinde kuyuları ultra-düşük bağlanma plakaları 96-aktarılmıştır oluşturulur. Dört gün sonra, EBS yüksek verim ve homojenliği de ölümcül diferansiye nöronların doğuran üzerinden kaplanmış olabilir. Alternatif olarak, gün-4 EBS tek hücre halinde ayrılmış ve insan nöronların düşük yoğunluklu mono tabakaları ile sonuçlanan, örneğin dışarı kaplama. Koherent sonuçlar şimdiye kadar iki bağımsız de elde edilmiştirrived hESC hatları, HuES6 ve NCL3.
Bir ön koşul olarak, başarılı EB oluşum birlikte HESC hayatta kalma 13-14 teşvik etmek için bilinen KAYA inhibitörü Y-27632 ile birlikte, bir sentetik polimer, polivinil alkol (PVA) kullanımı üzerinde sıkı bir şekilde bağlı olduğu anlaşılmıştır. Sonuç olarak, EBS homojenliği 96-V-plakaları içinde oluşan büyük ölçüde rasgele bölme tekniklerine dayalı kütle kültürler olarak EBS oluşumu göre geliştirilmiştir. Bu sistem, bu nedenle yapışkan koşullar altında yüksek kontrollü nöron oluşumu, ardından süspansiyon kültürü içinde nöroektodermin oluşumu için önemli ölçüde geliştirilmiş bir platform sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim önceden yayınlanmış prosedürü dahil olmak üzere 10 hPSCs, gelen EB oluşumunu gerektirmeyen En farklılaşma protokolleri manuel veya kaçınılmaz EB boyutlarda heterojenite neden agrega gibi hESC enzim destekli hasat dayanmaktadır. Bu durum, bu şekilde üretilen bir orta boyutta, özellikle de sistematik analiz zor hale getirir bazı hücre çizgilerinden ile farklılaşması verim olarak değişkenlik yol açar. Ayrıca, manuel diseksiyon kendisi tarafından ölçeklenebilirlik ödün hangi …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Max Planck Topluluğu tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
