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La produzione eterologa di complessi prodotti naturali è un approccio progettato per affrontare le attuali limitazioni e le possibilità future. È particolarmente utile per quei composti che possiedono un valore terapeutico ma non può essere sufficientemente prodotto o trarrebbero beneficio da una nuova forma di produzione. Le procedure sperimentali oggetto può essere suddiviso in tre componenti: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione eterologa e 3) l'analisi del prodotto. Ogni componente sperimentale è in fase di continua ottimizzazione per affrontare le sfide e anticipare le opportunità associati a questo approccio emergente.
Biosintesi eterologa inizia con l'identificazione di una sequenza genetica responsabile di un prodotto naturale. Trasferire questa sequenza in un ospite eterologo è complicata dalla complessità via biosintetica responsabile della formazione del prodotto. L'antibiotico eritromicina A è un buon esempio. Venti geni (pari a> 50 kb) sono necessari per la biosintesi eventuale. Inoltre, tre di questi geni codificano megasynthases, multi-dominio enzimi ciascuna ~ 300 kDa nella dimensione. Questo materiale genetico devono essere progettati e trasferiti E. coli per la biosintesi ricostituito. L'uso di isolamento PCR, costruzione operone, multi-cystronic plasmidi, ed elettro-trasformazione sarà descritto nel trasferire l'eritromicina Un cluster genetico E. coli.
Una volta trasferita, la E. coli cella deve supportare biosintesi finale. Questo processo è anche impegnativo viste le differenze sostanziali tra E. coli e la maggior parte dei padroni di casa originali responsabili della complessa formazione del prodotto naturale. La cella deve fornire substrati necessari a sostenere la biosintesi e coordinately esprimere il cluster trasferito genetica di produrre enzimi attivi. Nel caso di eritromicina A, la E. coli cella doveva essere progettato per fornire i due precursori (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA) necessari per la biosintesi. Inoltre, le modifiche di sequenze genetiche, il numero di copie del plasmide, chaperonin co-espressione, post-traslazionale modifica enzimatica, e la temperatura di processo sono stati anche tenuti a consentire eritromicina finale Una formazione.
Infine, la produzione di successo deve essere valutata. Per l'eritromicina Un caso, presenteremo due metodi. La prima è la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) per confermare e quantificare la produzione. La bioattività di eritromicina A sarà inoltre confermata mediante uso di un saggio biologico in cui viene testata l'attività antibiotica contro il Bacillus subtilis. I saggi di valutazione stabiliscono eritromicina A biosintesi da E. coli e posto le basi per i futuri sforzi di progettazione per migliorare o diversificare la produzione e per la produzione di nuovi composti naturali complessi che utilizzano questo approccio.