The Logic, eksperimentelle trin, og potentialet i Heterolog Natural Product Biosyntese Med den Complex antibiotikum erythromycin A produceret gennem<em> E. coli</em

Summary

Det heterologe biosyntese af erythromycin A til<em> E. coli</em> Omfatter følgende eksperimentelle trin: 1) genetisk overførsel, 2) heterolog rekonstituering og 3) produkt analyse. Hvert trin vil blive forklaret i forbindelse med motivation, potentiale og udfordringer i at producere terapeutiske naturlige produkter ved hjælp af<em> E. coli</em> Som en surrogat vært.

Abstract

Det heterologe produktion af komplekse naturlige produkter er en tilgang designet til at løse de nuværende begrænsninger og fremtidige muligheder. Den er særlig anvendelig til sådanne forbindelser, der har terapeutisk værdi, men kan ikke i tilstrækkelig grad produceret eller vil have gavn af en forbedret form for produktion. De eksperimentelle procedurer på kan opdeles i tre komponenter: 1) genetisk overførsel, 2) heterolog rekonstitution og 3) produkt analyse. Hver eksperimentel komponent er under løbende optimering at møde de udfordringer og foregribe de muligheder, der er forbundet med denne nye tilgang.

Heterolog biosyntesen begynder med identifikation af en genetisk sekvens der er ansvarlig for et værdifuldt naturprodukt. Overførsel af denne sekvens til en heterolog vært kompliceres af biosyntesevejen kompleksitet ansvarlig for produktdannelse. Den antibiotikum erythromycin A er et godt eksempel. Tyve gener (i alt> 50 kb) er påkrævet til endelig biosyntese. Endvidere koder for tre af disse gener megasynthases, multi-domæne-enzymer hver ~ 300 kDa i størrelse. Dette genetiske materiale skal være konstrueret og overført til E. coli for rekonstitueret biosyntese. Anvendelsen af PCR isolation, operon konstruktion, multi-cystronic plasmider, og elektro-transformation vil blive beskrevet overføre erythromycin A genetiske klynge til E. coli.

Når først overføres, E. coli-celle skal understøtte eventuelle biosyntese. Denne proces er også en udfordring på grund af de betydelige forskelle mellem E. coli og mest originale værter ansvar for komplekse naturprodukt dannelse. Cellen skal stille de nødvendige substrater til støtte for biosyntese og koordineret udtrykke det overførte genetiske klynge til at producere aktive enzymer. I forbindelse med erythromycin A, E. coli-celle måtte konstrueres til at tilvejebringe de to forstadier (propionyl-CoA og (2S)-methylmalonyl-CoA), der kræves til biosyntese. Desuden blev gen sekvensmodifikationer, plasmidkopital, chaperonin co-ekspression, posttranslationel enzymatisk modifikation, og procestemperaturen også for at muliggøre endelig erythromycin A formationen.

Endelig skal vellykket produktion vurderes. For erythromycin A tilfældet, vil vi præsentere to metoder. Den første er væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) for at bekræfte og kvantificere produktionen. Bioaktiviteten af erythromycin A vil også blive bekræftet ved anvendelse af et bioassay, hvor den antibiotiske aktivitet testes mod Bacillus subtilis. De vurderingskriterier, assays etablerer erythromycin A biosyntese fra E. coli og satte scenen for den fremtidige tekniske indsats for at forbedre eller diversificere produktionen og til fremstilling af nye komplekse naturlige forbindelser under anvendelse af denne fremgangsmåde.

Introduction

Erythromycin A er et polyketid antibiotikum produceret af Gram-positive jordbakterie Saccharopolyspora erythraea, og nuværende produktion er blevet gradvist forbedret til ~ 10 g / L gennem årtiers traditionel mutagenese og screening protokoller og senere ved procesoptimering ordninger ^1-6. Mutagenese og screening strategier er almindelige i antibiotikum naturprodukt udvikling som følge af vanskeligheder i dyrkning og / eller genetisk manipulation af indfødte produktions værter og på grund af den let tilgængelige antibiotisk aktivitet eller forbedrede vækst fænotyper at hjælpe valget. I forbindelse med erythromycin A, S. erythraea er begrænset af en langsom vækst profil og manglen på mere direkte genetiske manipuleringsteknikker (i forhold til organismer som E. coli), således hindrer hurtige forbedringer i produktion og biosyntesen af nye derivater. Efter at have anerkendt de produktionsproblemer og ulåst diversificatipå mulighederne med forbindelser som erythromycin A, begyndte forskerne at forfølge ideen om heterologe biosyntese (figur 1) ^7. Disse bestræbelser faldt sammen med tilgængelige sekvensinformation for erythromycin A-genklyngen ^8-11. Det skal understreges, at antallet af sekventerede komplekse naturlige produkter genklynger høj grad har udvidet ^12-16, giver afsæt for en fortsat indsats i heterolog biosyntese at få adgang til kodet medicinske potentiale. For at gøre dette, heterolog rekonstituering kræver, at den nye vært opfylde behovene i den specifikke biosyntetiske pathway. E. coli giver teknisk bekvemmelighed, en bred spænder sæt molekylærbiologiske teknikker, og metaboliske og procesteknik strategier for produktudvikling. Men sammenlignet med native produktion værter, E. coli udviser ikke den samme grad af komplekse naturprodukt produktion. Det var derfor uvist, om E. coli kunne tjene som en levedygtig heterolog mulighed for komplekse naturprodukt biosyntese. Imidlertid blev det antaget, at E. coli ville være en ideel værtsorganisme, hvis heterologt biosyntese kunne opnås.

Med dette mål for øje, begyndte indledende bestræbelser på at producere den polyketid aglycon 6-deoxyerythronolide B (6dEB) gennem E. coli. Imidlertid nativt E. coli metabolisme kunne ikke give mærkbare niveauer af propionyl-CoA, og (2S)-methylmalonyl-CoA forstadier nødvendige for at støtte 6dEB biosyntese eller kunne den nye vært posttranslationelt modificere deoxyerythronolide B synthase (DEBS) enzymer. For at afhjælpe disse problemer blev en metaboliseringsvej består af indfødte og heterologe enzymer indbygget i E. coli, således at exogent fodret propionat blev omdannet intracellulært til propionyl-CoA, og derefter (2S)-methylmalonyl-CoA, under teknik til at fuldføre denne vej, blev en SFP-gen anbragt i the kromosomet af E. coli BL21 (DE3) til frembringelse af en ny stamme betegnet BAP1. The SFP enzym er en phosphopantetheinyl transferase stand til fastgørelse af 4'-phosphopantetheine cofaktor til Debs enzymer ^17,18. De tre Debs gener (hver ~ 10 kb) blev derefter anbragt på to separat valgbare ekspressionsvektorer indeholdende inducerbare T7-promotorer. Efter justeringen af post-induktion temperaturen (til 22 ° C) blev Debs gener koordineret udtrykt i BAP1 i en aktiv tilstand kan generere 6dEB ^19.

Forfølgelsen af fuld erythromycin A biosyntesen derefter begyndte at bruge en analog genklyngen fra Micromonospora megalomicea eller en hybrid vej sammensat af gener fra S. erythraea, S. fradiae, og S. venezuelae der producerede den mellemprodukterne erythromycin C og 6-deoxyerythromycin D, henholdsvis ^20-22. Senest har vores gruppe udvidet disse bestræbelser ved at producere erythromycin A (den mest klinisk relevant form for erythromycin) gennem E. coli. I modsætning til tidligere arbejde, koordineret vores strategi udtrykte 20 original S. erythraea gener er nødvendige for polyketid biosyntese, deoxysugar biosyntese og fastgørelse, ekstra skrædderi, og selv-modstand (figur 2). I alt blev 26 (native og heterologe) gener manipulerede så E. coli til at producere erythromycin A med 4 mg / L ^23,24. Dette resultat er etableret komplet produktion af et komplekst polyketid naturprodukt med E. coli og tjener som grundlag for at udnytte denne nye produktion option eller forfølge nye.

Protocol

Teksten nedenfor er specifikt for erythromycin A antibiotikum, men trinnene er udformet til at være generelt anvendelig til andre naturlige produkter som kandidater til heterolog biosyntese. 1. Erythromycin A Genetic Cluster Transfer Design PCR-primere til at amplificere alle de gener, der er forbundet med erythromycin A klynge i S. erythraea kromosom. Dette trin er specifikke for disse naturlige produkter kandidater, hvis genetiske sekvenser er blevet bestemt. Alternati…

Representative Results

Det ønskede resultat af denne fremgangsmåde er fremstillingen af en fuldt bioaktive naturligt produkt fra E. coli heterologe vært. Dette er bedst repræsenteret ved de LC-MS resultater anvendes til at bekræfte og kvantificere produktion (fig. 6), og den antibakterielle bioassay anvendes til at bekræfte den endelige aktivitet (figur 7). I den samlede ordning af heterologt biosyntese, definerer dette resultat succes. Når udført, forskningsindsats og derefter henvende sig t…

Discussion

Kritiske trin i heterolog biosyntesen er stødt på hver af de tre punkter i processen: 1) genetiske overførsel, 2) biosyntetiske rekonstitution og 3) produkt analyse. Et problem på noget tidspunkt vil afspore den ultimative målsætning om heterolog biosyntese. Måske er den mest udfordrende aspekt af processen etablerer rekonstitueret biosyntese, da dette absolut er nødvendigt, for vellykket analyse. Imidlertid rekonstitution afhænger af omhyggeligt design og overførsel af det genetiske materiale, der er ansvarli…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PCR machine	Eppendorf	Mastercycler personal
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231
Electroporator	BioRad	Micropulser
IPTG	Fisher	BP1620
Sodium propionate	Sigma	P1880
L-arabinose	Sigma	A3256
Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	MaxQ 4000
Microfuge	Eppendorf	Centrifuge 5415D
pGro7	Takara	Chaperone Plasmid Set (3340)
pET21, pET28, pCDF-Duet-1	EMD Chemicals	69742-3, 69864, 71340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Ethyl acetate	Sigma	270989
Methanol	Sigma	322415
Vacuum centrifuge	Eppendorf	Concentrator 5301
Rotary Evaporator	Buchi	R-200