Den<em> Drosophila</em> Netthinnen er en krystall-lignende gitter sammensatt av et lite antall av celletyper som er generert i en stereotyp måte<sup> 1</sup>. Sin amenability til sofistikert genetisk analyse gjør studiet av komplekse utviklingsprogrammene. Denne protokollen beskriver disseksjoner og immunhistokjemi av netthinne på tre diskrete utviklingsstadier, med fokus på fotoreseptoren differensiering.
Den sammensatte øye Drosophila melanogaster består av ca 750 ommatidia (enhet øyne). Hver ommatidium består av ca 20 celler, inkludert objektiv-sekresjon membran celler, pigment celler, en bust celle og åtte fotoreseptorene (PRS) R1-R8 to. PRS har spesialisert microvillar strukturer, de rhabdomeres, som inneholder lysfølsomme pigmenter, de Rhodopsins (RHS). De rhabdomeres av seks PRS (R1-R6) danner et trapes og inneholder RH1 3 4. De rhabdomeres av R7 og R8 er plassert i tandem i sentrum av trapezoid og dele den samme banen av lys. R7 og R8 PRs stokastisk uttrykker ulike kombinasjoner av RHS i to undergrupper 5: I "p" undertype, er RH3 i p R7s kombinert med RH5 i p R8s, mens i "y" undertype, er RH4 i y R7s forbundet med RH6 i y R8s 6 7 8.
Tidlig spesifikasjon av PRs og utvikling av ommatidia begynner i larve øye-antennal imaginal plate, en monolayer av epitelceller. En bølge av differensiering feier over disk 9 og initierer montering av udifferensierte celler til ommatidia 10-11. The 'grunnlegger celle' R8 er spesifisert først og rekrutterer R1-6 og deretter R7 12-14. Deretter, i løpet pupal utvikling, fører PR differensiering til omfattende morfologiske endringer 15, inkludert rhabdomere formasjon, synaptogenesis og til slutt rh uttrykk.
I denne protokollen beskriver vi metoder for netthinnens disseksjoner og immunhistokjemi på tre definerte perioder med netthinnen utvikling, som kan brukes til å løse en rekke spørsmål om retinal formasjon og utviklingsmessige veier. Her bruker vi disse metodene for å visualisere en trinnvis PR differensiering på enkelt-celle-nivå i hele mount larve, midpupal og voksen netthinne ( <sTrong> Figur 1).
1. Feilsøking
I vår erfaring, disseksjoner krever praksis (opptil flere uker) og er tilrettelagt av å oppnå en komfortabel håndstilling 21 ved hvile albuene og underarmene på bordet, og med fingrene å ta kontakt med disseksjon parabolen. På den måten, bare tommelen, indeksen og midtre fingrene utføre subtile bevegelser.
Fjerne lamina uten å skade fotoreseptorene er trolig den mest utfordrende trinnet. Praksis med rød-eyed wildtype flyr først …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Ehrman fellesskap å HY. H., en Jane Coffin Childs minnefond for Medical Research postdoktorstipend til RJJ, NIH Grant F32EY016309 til DV, en New York University Dean Dissertation Fellowship til DJ, GrantR01 EY13010 NIH til CD og en DFG fellesskap å JR (RI 2208/1- 1). Vi takker Nina Vogt og Pamela Boodram for kommentarer til manuskriptet.
Reagent | |||
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
Equipment | |||
Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
Clear nail polish or Scotch tape | |||
Orbital shaker | Bellco | ||
Slide holder box | Fisher Scientific | ||
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Thin paintbrush | |||
P20 and P200 micropipettes and tips | |||
Dissecting microscope | |||
Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |