Determinazione delle acidità in fase gassosa di oligopeptidi

Sommario

La determinazione delle acidità fase gas di oligopeptidi contenenti cisteina è descritto. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Le acidità relative dei peptidi sono valutate con esperimenti di dissociazione indotta da collisione, e le acidità quantitativi sono determinati utilizzando i Cuochi estesi metodo cinetico.

Abstract

Residui amminoacidici situati in posizioni differenti in proteine ​​ripiegate spesso mostrano diversi gradi di acidità. Per esempio, un residuo di cisteina situato in prossimità o al N-terminale di un elica è spesso più acido che in prossimità o al C-terminale ^1-6. Sebbene ampi studi sperimentali sulle proprietà acido-base di peptidi sono stati effettuati nella fase condensata, in particolare in soluzioni acquose ^6-8, i risultati sono spesso complicati da effetti solvente ^7. Infatti, la maggior parte dei siti attivi di proteine ​​si trovano vicino alla regione interna in cui sono stati minimizzati effetti del solvente ^9,10. Per comprendere intrinseche proprietà acido-base di peptidi e proteine, è importante effettuare gli studi in un ambiente privo di solventi.

Presentiamo un metodo per misurare le acidità degli oligopeptidi in fase gas. Usiamo una cisteina contenente oligopeptide, Ala ₃ CysNH 3 CH), come composto modello. Le misurazioni sono basate sul metodo cinetico esteso Cuochi consolidata (Figura 1) ^11-16. Gli esperimenti vengono eseguiti usando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo interfacciato con ionizzazione elettrospray (ESI) sorgente di ioni (Figura 2). Per ogni campione peptide, sono selezionati diversi acidi riferimento. Gli acidi di riferimento sono composti organici strutturalmente simili con noti acidità in fase gas. Una soluzione della miscela del peptide e un acido riferimento viene introdotta nello spettrometro di massa, ed una fase gassosa protone-bound gruppo anionico di acido-peptide di riferimento è formato. Il cluster protone-bound è massa isolata e successivamente frammentata tramite dissociazione (CID) esperimenti di collisione-indotte. I risultanti abbondanze di ioni frammento vengono analizzati utilizzando un rapporto tra le acidità e il cluster di ioni dissociazione cinetica. L'acidità fase gas del peptide è poi ottenito da regressione lineare delle trame termo-cinetica ^17,18.

Il metodo può essere applicato ad una varietà di sistemi molecolari, compresi i composti organici, amminoacidi e loro derivati, oligonucleotidi e degli oligopeptidi. Confrontando le acidità fase gas misurati sperimentalmente con quei valori calcolati per i diversi conformeri, effetti conformazionali sui acidità possono essere valutati.

Introduzione

Le acidità di residui di aminoacidi sono tra i più importanti proprietà termochimici che influenzano le strutture, la reattività, e dei processi di piegatura-unfolding di proteine ^​​9,19. Residui di singoli aminoacidi mostrano spesso diverse acidità efficaci a seconda delle loro posizioni in proteine. In particolare, i residui presenti in altri siti attivi presentano spesso perturbato significativamente acidità. Un esempio è il residuo di cisteina che risiedono nei siti attivi della tioredossina super-famiglia di enzimi ^20,21. Il sito attivo è insolitamente cisteina acido rispetto a quelle in dispiegato proteine ^​​3-5. È stato suggeri....

Protocollo

1. Preparazione delle soluzioni campione

1. Prima preparare le soluzioni madre del peptide e gli acidi riferimento sei usando un solvente misto di metanolo e acqua in un rapporto in volume di 1:1. Le soluzioni madre dovrebbero avere una concentrazione di circa 10 ^-3 M.
2. Pesare 1 mg del campione peptide solido, A ₃ CH, in una provetta Eppendorf 1,5 ml e aggiungere 1,0 ml di solvente misto di metanolo e acqua, e miscelare con un vortice.
3. Pesare 1 mg di acido difluoroacetic (DFAH) e aggiungere 1,0 ml di solvente misto di metanolo e acqua, e mescolare con un vortice.
4. Utilizzare la stessa procedura per rendere le ....

Risultati

1. Gli esperimenti bracketing CID forniscono informazioni sui relativi acidità del peptide rispetto agli acidi riferimento selezionati. Due rappresentativo spettri CID del peptide (A ₃ CH) con due acidi riferimento, DFAH e Mbah, sono mostrati in Figura 3. In Figura 3a all'abbondanza ione (altezza picco) del peptide ione è più debole di quella del DFA ¯, e in Figura 3b, l'abbondanza ione dello ione peptide è più forte di quello del MBA ¯. I due spettri suggeriscono che l.......

Discussione

La misurazione di successo della acidità in fase gassosa di un peptide basa in gran parte sulla selezione di acidi riferimento adeguati. Gli acidi riferimento ideali sono composti organici strutturalmente simili con valori di acidità in fase gas ben consolidati. Gli acidi riferimento dovrebbero avere strutture simili tra loro. Ciò garantirà un simile entropia di deprotonazione per ciascuno degli acidi riferimento del set. Gli acidi di riferimento devono avere valori di acidità prossimi a quelli dei peptidi. Per brevi ol.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Spettrometro di massa	Varian	1200 L e 320 L
Acido cloroacetico	Sigma-Aldrich	402923
Acido bromoacetico	Sigma-Aldrich	B56307
Acido difluoroacetico	Sigma-Aldrich	142859
Acido dicloroacetico	Sigma-Aldrich	D54702
Acido dibromoacetico	Sigma-Aldrich	242357
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	T6508