Fastställande av gasfas Acidities av Oligopeptider
Summary
Fastställandet av gas-fas acidities av cysteininnehållande oligopeptider beskrivs. Experimenten utförs med användning av en trippel kvadrupol masspektrometer. De relativa acidities av peptiderna mäts med kollisionen-dissociation experiment, och de kvantitativa acidities fastställs med utökade Cooks kinetisk metod.
Abstract
Aminosyrarester belägna vid olika positioner i veckade proteiner uppvisar ofta olika grader av acidities. Till exempel är en cysteinrest belägen vid eller nära N-terminalen av en helix ofta surare än den vid eller nära C-terminalen 1-6. Även om omfattande experimentella undersökningar i syra-bas-egenskaper hos peptider har utförts i den kondenserade fasen, i synnerhet i vattenlösningar 6-8, är resultaten ofta kompliceras av lösningsmedelseffekter 7. I själva verket är de flesta av de aktiva ställena i proteiner beläget nära det inre region där lösningsmedelseffekter har minimerats 9,10. För att förstå inneboende syra-bas egenskaper hos peptider och proteiner, är det viktigt att utföra studierna i en lösningsmedelsfri miljö.
Vi presenterar en metod för att mäta de acidities av oligopeptider i gasfas. Vi använder ett cysteininnehållande oligopeptid, Ala 3 CysNH <sub> 2 (A 3 CH), som modell föreningen. Mätningarna är baserade på väletablerade förlängda Cooks kinetisk metod (figur 1) 11-16. Experimenten utförs med användning av en trippel-kvadrupol masspektrometer gränssnitt med en elektrospray (ESI) jonkälla (figur 2). För varje peptid prov, finns flera referenspunkter syror valt. De referensnivåer syrorna är strukturellt liknande organiska föreningar med kända gas-fas acidities. En lösning av blandningen av peptiden och en referens-syra införes i masspektrometern, och en gas-fas proton-bunden anjonisk kluster av peptid-referens syra bildas. Den proton-bundna kluster massa isoleras och därefter fragmenterad via kollision-dissociation (CID) experiment. De resulterande fragmentjon abundances analyseras med en relation mellan acidities och klustret jon dissociation kinetik. Den gasfas surhet av peptiden är sedan obtaiNed genom linjär regression av termo-kinetiska tomter 17,18.
Metoden kan tillämpas på en mängd olika molekylära system, däribland organiska föreningar, aminosyror och deras derivat, oligonukleotider och oligopeptider. Genom att jämföra gas-fas acidities mätt experimentellt med de beräknade värdena för olika konformerer kan konformationella effekter på acidities utvärderas.
Introduction
De acidities av aminosyror är bland de viktigaste termokemiska egenskaper som påverkar strukturer, reaktivitet, och den fällbara-utspelas processer proteiner 9,19. Individuella aminosyrarester visar ofta olika effektiva acidities beroende på sina platser i proteiner. I synnerhet resterna belägna vid de aktiva ställena uppvisar ofta störs avsevärt acidities. Ett sådant exempel är cysteinresten som är bosatt i de aktiva ställena i thioredoxin super-familj av enzymer 20,21. Den aktiva cystein är ovanligt surt jämfört med dem i ovikta proteiner 3-5. Det har föreslagits att den spiralformiga konformationen kan ha ett betydande bidrag till den ovanliga surhet. Det finns omfattande experimentella undersökningar i syra-bas-egenskaper av peptider som utförs i lösningar, särskilt i vattenlösningar 2,6-8. Resultaten var ofta kompliceras av lösningsmedelseffekter7. I själva verket är de flesta av de aktiva ställena i proteiner beläget nära det inre region där lösningsmedelseffekter minimeras 9,10.
För att förstå inneboende syra-bas-egenskaper av peptider och proteiner, är det viktigt att genomföra studier i ett lösningsmedel-fri miljö. Här presenterar vi en masspektrometri-metod för bestämning av gasfas-surhet. Den metod kallas den förlängda Cooks kinetisk metod. Denna metod har med framgång tillämpas på ett brett spektrum av kemiska system för bestämning av olika termokemiska egenskaper, såsom gasfas-surhet, protonen affinitet, metalljonen affinitet, elektronstrålekanonen affinitet och den joniseringsenergi 11-15, 22-26. Vi har tillämpat denna metod för att bestämma de gas-fas acidities av en serie av oligo cystein-polyalanin och cystein-polyglycin peptiderna 17,18,27. Dessa studier visar att den N-terminala cysteinet peptides är betydligt surare än motsvarande C-terminala sådana. De höga acidities av den tidigare är sannolikt på grund av de spiralformade konformationella effekterna där tiolatanjon starkt stabiliseras genom interaktion med Helix makro-dipol. På grund av den icke-flyktiga och termiskt labila naturen av peptider, är den kinetiska metoden den mest praktiska tillvägagångssätt tillgängliga för närvarande för att producera någorlunda korrekt syra-bas termokemiska mängder av peptider 28.
Den allmänna ordningen och ekvationen associerat med den kinetiska metod visas i figur 1. Fastställandet av gas-fas surhet en peptid (AH) börjar med bildandet av en serie av proton-bundna kluster anjoner, [A • H • A i] ¯ (eller [A ¯ • H + • En i ¯] ¯), i jonkällan regionen av masspektrometer, där A ¯ och Aj ¯ är de deprotonerade former av peptiden ochde referensnivåer syror, respektive. De referensnivåer syror är organiska föreningar med kända gas-fas acidities. Referensvärdena syror bör ha strukturer som liknar varandra (men inte nödvändigtvis liknande den av peptiden). Likheten av strukturerna mellan referens syror säkerställer likheten mellan entropies av avprotonering bland dem. Den proton-bundna kluster anjoner är massproducerade väljs och collisionally aktiveras och därefter dissocieras användning kollision-dissociation (CID) experiment för att ge de motsvarande monomera anjoner, A ¯ och Aj ¯, med konstanterna för k och k i, respektive, som visas i fig 1a. Om sekundära splittringarna är försumbara, mängdförhållandet mellan de CID fragmentjoner, [A ¯] / [Aj ¯], representerar ett ungefärligt mått på förhållandet mellan konstanterna, k / k i. Under antagandet att det inte finns någon omvänd aktiveradion hinder för både dissociation kanaler, CID produktjon grenkvoter, ln [A ¯] / [A Jag ¯], kommer linjärt korrelerad till gasfas surhet av peptiden (Δ acid H) och för de referens-syror (Δ acid H I), som visas i figur 1b. I denna ekvation är Δ syra H avg den genomsnittliga gas-fas surhet av referens-syror, är Δ (Δ S) entropin sikt (vilket kan antas vara konstant om referens syrorna är strukturellt lika varandra), R universella gaskonstanten, och T eff är den effektiva temperaturen i systemet. Den effektiva temperaturen är en empirisk parameter som beror på flera experimentella variabler, inklusive kollisionsenergin.
Värdet på gasfas-surhetsgrad bestäms genom att konstruera två uppsättningar av termo-kinetiska tomter. Den första uppsättningen är obupprätthålls genom plottning ln ([A ¯] / [Ai ¯]) mot Δ acid H i – Δ syra H avg, såsom visas i fig. 4a. Linjär regression kommer att ge en uppsättning av raka linjer med sluttningarna av X = 1 / RT EFF och fångar i Y = – [Δ acid H – Δ acid H avg] / RT eff – Δ (Δ S) / R. Den andra uppsättningen tomter erhålls genom att plotta de resulterande fångar (Y) från den första uppsättningen mot motsvarande backar (X), som visas i figur 4b. Linjär regression ger en ny linje med en lutning av Δ acid H – Δ acid H avg och en skärningspunkt Δ (Δ S) / R. Värdet av Δ syra H erhålls sedan från lutningen och entropi sikt Δ (Δ S), erhålls fråninterceptet.
Experimenten utförs med användning av en trippel kvadrupol masspektrometer gränssnitt till en elektrospray (ESI) jonkälla. Ett schematiskt diagram över masspektrometern visas i figur 2. De CID experiment utförs i massa välja proton-bundna kluster anjoner med den första kvadrupol enheten och låta dem genomgå kollisioner med argonatomer läckte av kollisionen kammare som hålls vid ett tryck av ca 0,5 mTorr. Dissociation produkt joner massa analyseras med den tredje quadrupole enheten. CID-spektra registreras vid flera kollisionsenergier med m / z-intervall tillräckligt bred för att täcka alla möjliga sekundära fragment. CID produkt jonintensiteter mäts genom att ställa instrumentet i den valda reaktion övervakning (SRM) läge där skanningen är inriktad på utvalda produktområden joner. CID experiment utförs vid fyra olika kollisionsenergier, motsvarandecentrum-of-massa energier (E cm) av 1,0, 1,5, 2,0, och 2,5 eV, respektive. I mitten-av-massa energi beräknas enligt följande ekvation: E cm = E lab [m / (M + m)], där E lab är kollisionsenergin i laboratoriet ram, m är massan av argon, och M är massan av den proton-bundna kluster jon.
I den här artikeln använder vi oligopeptiden Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som modell föreningen. C-terminalen är amiderad och tiolgruppen (SH) i cysteinresten blir det sura området. Valet av lämpliga referensvärden syrorna är avgörande för en framgångsrik mätning av gas-fas surhet. Den idealiska referens syrorna är strukturellt likartade (varandra) organiska föreningar med väletablerade gas-fas surhetsgrad värden. Referensvärdena syror bör ha syra värden nära den hos peptiderna. För peptid A 3 CH, halogenerade sex carboxylic syror väljs som referens syror. De sex referenspunkter syror är klorättiksyra (MCAH), bromättiksyra (Mbah), difluorättiksyra (DFAH), diklorättiksyra (DCAH), dibromoacetic syra (DBAH), och tri (TFAH). Två av dem, kommer DFAH och Mbah, användas för att illustrera protokollet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den framgångsrika mätning av gas-fas surhet en peptid bygger till stor del på valet av lämpliga referensvärden syror. Den idealiska referens syrorna är strukturellt liknande organiska föreningar med väletablerade gas-fas surhetsgrad värden. Referensvärdena syror bör ha liknande strukturer till varandra. Detta kommer att säkerställa en likartad entropi deprotonation för varje referens syrorna i uppsättningen. Referensvärdena syror bör ha syra värden nära de av peptiderna. För kortare cysteininnehålla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
References
- Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
- Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
- Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).
- Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase – the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
- Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
- Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
- Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
- Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
- Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
- Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
- Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
- Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
- Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
- Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
- Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
- Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
- Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
- Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
- Fersht, A. . Structure and mechanism in protein science. , (1999).
- Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
- Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
- Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
- Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
- Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
- Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
- Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
- Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
- Gutte, B. . Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).
- Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, 1-284 (1979).
- Chan, W. C., White, P. D. . Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).
