Isolering af primær melanocytstimulerende lignende celler fra mus Heart

Summary

I denne protokol, w e identificeret en ny population af melanocytstimulerende lignende celler (også kendt som kardiale melanocytter) i hjerterne på mus og mennesker, der bidrager til atriearytmien udløser i mus.

Abstract

Vi identificerede en ny population af melanocytstimulerende lignende celler (også kendt som kardiale melanocytter) i hjerterne på mus og mennesker, der bidrager til atriearytmien triggers i mus. For at undersøge de elektriske og biologiske egenskaber kardiologiske melanocytter vi udviklet en procedure for at isolere dem fra mus hjerter, vi stammer fra dem, designet til at isolere neonatale murine kardiomyocytter. For at opnå sundere kardiale melanocytter er egnede til mere omfattende patch clamp eller biokemiske undersøgelser, har vi udviklet en raffineret fremgangsmåde til isolering og forkromning kardiale melanocytter baseret på dem, der oprindeligt designet til at isolere kutane melanocytter. Den raffinerede procedure påvises i denne anmeldelse og producerer større mængder af sunde melanocytstimulerende-lignende celler, som kan være belagt som en ren population eller med kardiomyocytter.

Introduction

Vi har for nylig identificeret en ny celle population i hjertet af mus og mennesker, der udtrykker melanin syntese enzymer og morfologisk ligner kutane melanocytter. Vi kaldes disse cellers kardiale melanocytter 'og fundet de er til stede i anatomiske steder, hvorfra atriearytmien udløser ofte oprindelse i mennesker. Vi fandt også kardiologiske melanocytter bidrage til atrial arytmi i mus med germlinie sletning af DCT. Hjerte melanocytter er tyndt fordelt i hele musen atrium, hvor de omfatter mindre end 0,1% af alle atrielle celler. For at undersøge de elektriske og biologiske egenskaber kardiologiske melanocytter vi udviklet en procedure for at isolere dem fra muse-hjerte ved hjælp af Cre-inducerbare melanocytstimulerende specifikke markører. Vores indledende procedure blev udviklet fra dem, der anvendes til at isolere neonatale murine cardiomyocytter og gav meget lille antal celler, der er egnede til patch clamp optagelser eller PCR-analyse. For at forbedre helbredeth og levedygtighed af hjerte melanocytter, for mere dybtgående elektrofysiologiske analyser eller biokemiske undersøgelser, har vi udviklet en raffineret procedure fra dem, designet til at isolere kutane melanocytter. Den beskrevne og demonstreret i denne anmeldelse fremgangsmåde har den fordel at producere sundere kardielle melanocytter, der kan være belagt som en ren population eller med kardiomyocytter.

Protocol

1. Forberedelse af de nødvendige løsninger og udstyr Først sterilisere kirurgiske instrumenter (lige form pincet, buet form pincet, lige form saks, og buede form saks) ved autoklavering dem i 15 min. ved 121 ° C. Forbered 2 sæt instrumenter, hvor det ene sæt bruges til at dissekere ud hjerter og det andet sæt vil blive brugt til hakning op vævet. Opløs 1 pakke MCDB153 kulturmedier i 900 ml steriliseret, filtreret vand og omrøres langsomt, indtil pulveret er opløst. Tilsæt 1,2 g natriumbi…

Representative Results

Beskrevet i denne artikel protokol er en forbedret teknik i forhold til den, vi tidligere offentliggjorte til isolering kardiale melanocytter fra den murine hjerte. Denne procedure anvender brugen af ​​fluorescerende markører drevet af melanin syntese enzym-specifik Cre-rekombinase at mærke kardiale melanocyt-lignende celler. Det er vigtigt at bruge en markør til at mærke kardiale melanocytter, når der arbejdes med frisk isolerede embryoner eller neonatale celler, idet de morfologiske forskelle, der adskiller k…

Discussion

Hjerte melanocytter er til stede i anatomiske steder i hjertet, der almindeligvis giver anledning til atriearytmien udløsere. Disse regioner omfatter lungevenerne, atrioventrikulær ringformede, bageste venstre forkammer og foramen ovale (figur 4). For at forstå den rolle, disse celler spiller i arrhythmogenesis udvikler vi teknikker til at isolere dem og studere deres fysiologi. Vi erkendte dog, at forbedring af denne teknik til at give sundere og større mængder af kardiologiske melanocytter ville …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comment
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Dissolve in: Water
DPBS, no calcium no magnesium	Invitrogen	14190136	Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5%	Sigma-Aldrich	S5761 or S8761	Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140163	Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X
Fetal Bovine Serum	Life Technology	Certified	Working Conc.: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml
Dibutyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627	DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	10 mM acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml
Basic FGF	BD Biosciences	354060	Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml