Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz
Summary
In diesem Protokoll w e identifiziert eine neue Population von Melanozyten-ähnlichen Zellen (auch als Herz Melanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen, die an Vorhofrhythmusstörungen löst bei Mäusen bei.
Abstract
Wir identifizierten eine neue Population von Melanozyten-ähnlichen Zellen (auch als Herz Melanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen, die an Vorhofrhythmusstörungen Trigger in Mäusen bei. Um die elektrischen und biologischen Eigenschaften von Herz Melanozyten untersuchen wir ein Verfahren, um sie von Mäuseherzen, die wir von denen zur neonatalen Kardiomyozyten Maus zu isolieren abgeleitet isolieren entwickelt. Um gesünder Herz Melanozyten geeignet für umfangreichere Patch-Clamp-oder biochemische Untersuchungen zu erhalten, ein raffiniertes Verfahren entwickelt, die wir für die Isolierung und Beschichtung Herz Melanozyten basierend auf den ursprünglich entwickelt, um Haut-Melanozyten zu isolieren. Die raffinierte Vorgehensweise wird in diesem Beitrag gezeigt und produziert eine größere Anzahl von gesunden Melanozyten-ähnlichen Zellen, die als reine Population oder mit Kardiomyozyten beschichtet werden können.
Introduction
Wir haben vor kurzem identifiziert eine neuartige Zellpopulation im Herzen von Mäusen und Menschen, die Melanin-Synthese Enzyme zu exprimieren und morphologisch ähneln kutanen Melanozyten. Wir als "Herz Melanozyten" Diese Zellen und fanden sie in anatomischen Stellen, an denen Vorhofarrhythmie löst häufig bei Menschen stammen vorhanden sind. Wir fanden auch, Herz Melanozyten dazu beitragen, Vorhofrhythmusstörungen bei Mäusen mit Keimbahn Löschung von DCT. Herz Melanozyten dünn gesamten Maus Vorhof, wo sie weniger als 0,1% aller atrialen Zellen umfassen verteilt. Um die elektrischen und biologischen Eigenschaften von Herz Melanozyten untersuchen wir ein Verfahren, um sie von der Maus mit Herz Cre-induzierbare Melanozyten spezifische Marker zu isolieren entwickelt. Unsere ersten Verfahren wurde von denen zur neonatalen Kardiomyozyten murinen und ergab sehr kleine Zahl von geeigneten für Patch-Clamp-Aufnahmen oder PCR-Analyse entwickelt, Zellen zu isolieren. Jedoch zur Verbesserung der heilenten und die Lebensfähigkeit von Herz Melanozyten, für tiefer gehende Analyse elektrophysiologische oder biochemische Studien entwickelten wir ein verfeinertes Verfahren entwickelt, um von den Melanozyten der Haut zu isolieren. Die beschriebene und in diesem Beitrag gezeigt, Vorgehensweise hat den Vorteil, gesündere Herz Melanozyten, die als reine Population oder mit Kardiomyozyten beschichtet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herz Melanozyten sind in anatomischen Stellen innerhalb des Herzens, die häufig Anlass zu Vorhofarrhythmie Trigger vorhanden. Diese Regionen umfassen die Lungenvenen, den atrioventrikulären Annulus, das hintere linke Atrium und das Foramen ovale (Abbildung 4). Um die Rolle dieser Zellen in Arrhythmogenese spielen verstehen, entwickeln wir Techniken, um sie zu isolieren und studieren ihre Physiologie. Jedoch haben wir erkannt, daß eine Verbesserung dieser Technik ergeben gesünder und größeren Menge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Award R01 HL105734 zu VVPMDL gelagert ist, zum Teil, von der National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP ist eine innovative Forscher von der American Heart Association von Grant 11IRG900384 unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in: Water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% | Sigma-Aldrich | S5761 or S8761 | Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working Conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 10 mM
acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml |
Riferimenti
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
