Isolere Primær melanocytter lignende celler fra mus Hjerte

Summary

I denne protokollen, w e identifisert en roman befolkning på melanocyte lignende celler (også kjent som hjerte melanocytter) i hjertene til mus og mennesker som bidrar til atrial arytmi utløser hos mus.

Abstract

Vi identifiserte en roman befolkning på melanocyte lignende celler (også kjent som hjerte melanocytter) i hjertene til mus og mennesker som bidrar til atrial arytmi triggere i mus. For å undersøke de elektriske og biologiske egenskaper hjerte melanocytter vi utviklet en prosedyre for å isolere dem fra mus hjerter at vi stammer fra de som er laget for å isolere neonatale muse kardiomyocytter. For å få sunnere hjerte melanocytter egnet for mer omfattende patch clamp eller biokjemiske studier, har vi utviklet en raffinert metode for isolering og plating hjerte melanocytter basert på de som opprinnelig laget for å isolere kutane melanocytter. Den raffinerte fremgangsmåten er vist i dette og gir et større antall friske melanocyte-lignende celler som kan bli belagt som en ren populasjon eller med kardiomyocytter.

Introduction

Vi har nylig identifisert en roman cellepopulasjon i hjertet av mus og mennesker som uttrykker melanin-syntese enzymer og morfologisk ligner kutane melanocytter. Vi kalte disse cellenes kardiale melanocytter 'og funnet at de er tilstede i anatomiske steder hvorfra atrial arytmi utløser ofte har sin opprinnelse i mennesker. Vi fant også hjerte melanocyttene bidra til atriearytmier i mus med germline sletting av Dct. Hjerte melanocyttene er tynt fordelt over hele musen atrium der de utgjør mindre enn 0,1% av alle atrial celler. For å undersøke de elektriske og biologiske egenskaper hjerte melanocytter vi utviklet en prosedyre for å isolere dem fra musen hjertet ved hjelp av Cre-induserbar melanocyte spesifikke markører. Vår første prosedyren ble utviklet fra de som brukes til å isolere neonatale murine cardiomyocytes og gitt meget lite antall celler egnet for patch clamp opptak eller PCR analyse. Imidlertid, for å forbedre helbredeth og levedyktighet av hjerte melanocytter, for mer dyptgående elektrofysiologisk analyse eller biokjemiske studier, har vi utviklet en raffinert prosedyren fra de som er laget for å isolere kutane melanocytter. Den fremgangsmåte som er beskrevet og vist i dette har fordelen av å produsere sunnere hjerte melanocytter som kan bli belagt som en ren populasjon eller med kardiomyocytter.

Protocol

1. Forberede de nødvendige løsninger og utstyr Først sterilisere kirurgiske instrumenter (rett form tang, buede formen tang, rett form saks, og buede formen saks) ved autoklavering dem for 15 min. ved 121 ° C. Forbered 2 sett med instrumenter, der ett sett brukes til å dissekere ut hjertene og det andre settet skal brukes til hakking opp vevet. Løs opp 1 pakke MCDB153 kultur media i 900 ml sterilisert, filtrert vann og rør sakte til pulveret er oppløst. Tilsett 1,2 g natrium-bikarbonat, elle…

Representative Results

Protokollen er beskrevet i denne artikkelen er en forbedret teknikk i forhold til det vi tidligere utgitt for å isolere hjerte melanocytter fra murine hjerte. Denne fremgangsmåte anvender bruken av fluorescerende markører drevet av melanin syntese enzym-spesifikke Cre-rekombinase for å merke kardiale melanocyte-lignende celler. Det er viktig å bruke en markør for å merke hjerte melanocytter når du arbeider med fersk isolerte embryonale eller neonatale celler, siden de morfologiske forskjeller som skiller hjerte …

Discussion

Hjerte melanocyttene er tilstede i anatomiske steder i hjertet som ofte gir opphav til atrial arytmi triggere. Disse områdene omfatter lungevenene, atrioventrikulær ringrom, bakre venstre atrium og foramen ovale (figur 4). For å forstå hvilken rolle disse cellene spiller i arrhythmogenesis, vi utvikler teknikker for å isolere dem og studere deres fysiologi. Men vi anerkjent som å forbedre denne teknikken til å gi sunnere og større mengder av hjerte melanocytter ville tillate videre studier for ?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comment
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Dissolve in: Water
DPBS, no calcium no magnesium	Invitrogen	14190136	Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5%	Sigma-Aldrich	S5761 or S8761	Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140163	Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X
Fetal Bovine Serum	Life Technology	Certified	Working Conc.: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml
Dibutyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627	DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	10 mM acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml
Basic FGF	BD Biosciences	354060	Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml