Aislar las células melanocitos como primarios del corazón alfombrillas

Summary

En este protocolo, w e identificado una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a la arritmia auricular provoca en ratones.

Abstract

Identificamos una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a los factores desencadenantes de arritmia auricular en ratones. Para investigar las propiedades eléctricas y biológicas de los melanocitos cardíacos se desarrolló un procedimiento para aislarlos de los corazones del ratón que deriva de los diseñados para aislar los cardiomiocitos murinos neonatales. A fin de obtener los melanocitos cardíacos saludables adecuados para más extensa de patch clamp o estudios bioquímicos, hemos desarrollado un procedimiento de refinado para aislar y chapado melanocitos cardíacos basados ​​en los diseñado originalmente para aislar los melanocitos cutáneos. El procedimiento de refinado se demuestra en esta revisión y produce un mayor número de células melanocitos como saludables que pueden sembrarse como una población pura o con cardiomiocitos.

Introduction

Recientemente hemos identificado una población de células novela en el corazón de los ratones y los seres humanos que expresan enzimas melanina-síntesis y se asemejan morfológicamente a los melanocitos cutáneos. Llamamos 'melanocitos cardíacos' estas células y encontramos que están presentes en localizaciones anatómicas de la que la arritmia auricular desencadena a menudo se originan en los seres humanos. También encontramos melanocitos cardiacos contribuyen a las arritmias auriculares en ratones con deleción de la línea germinal de Dct. Melanocitos cardíacos se distribuyen escasamente lo largo de la aurícula del ratón donde se comprenden menos del 0,1% de todas las células auriculares. Para investigar las propiedades eléctricas y biológicas de los melanocitos cardíacos hemos desarrollado un procedimiento para aislarlos del corazón de ratón utilizando marcadores específicos de melanocitos Cre-inducible. Nuestro procedimiento inicial se desarrolló a partir de los que se usan para aislar los cardiomiocitos murinos neonatales y dado muy pequeños números de células adecuados para las grabaciones de patch clamp o análisis de PCR. Sin embargo, para mejorar la curarª y la viabilidad de los melanocitos cardíacos, por más profundo análisis electrofisiológico o estudios bioquímicos, se desarrolló un procedimiento de refinado de los diseñados para aislar los melanocitos cutáneos. El procedimiento descrito y demostrado en esta revisión tiene la ventaja de producir melanocitos cardíacos saludables que pueden sembrarse como una población pura o con cardiomiocitos.

Protocol

1. Preparar las soluciones y equipos necesarios En primer lugar, esterilizar los instrumentos quirúrgicos (pinzas rectas forma, fórceps forma curvada, tijeras de formas rectas y tijeras de formas curvas) en autoclave durante 15 min. a 121 ° C. Prepare 2 juegos de instrumentos, donde se utiliza un conjunto para la disección de los corazones y el otro conjunto se utilizarán para picar el tejido. Disuelva 1 paquete de MCDB153 medios de cultivo en 900 ml de esterilizado, agua filtrada y revuelva le…

Representative Results

El protocolo descrito en este artículo es una técnica mejorada en comparación con la que previamente publicados para el aislamiento de melanocitos cardíacos del corazón murino. Este procedimiento emplea el uso de marcadores fluorescentes impulsados ​​por la síntesis de melanina-enzima Cre-recombinasa específica para marcar las células melanocitos como cardíacas. Es importante usar un marcador para etiquetar melanocitos cardíacos cuando se trabaja con células embrionarias o neonatales recién aislados, pue…

Discussion

Melanocitos cardíacos están presentes en localizaciones anatómicas dentro del corazón que normalmente dan lugar a los factores desencadenantes de arritmia auricular. Estas regiones incluyen las venas pulmonares, el anillo atrioventricular, la aurícula izquierda posterior y el foramen oval (Figura 4). Para entender el papel que estas células juegan en arritmogénesis, desarrollamos técnicas para aislar a ellos y estudiar su fisiología. Sin embargo, nos dimos cuenta de que la mejora de esta técni…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comment
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Dissolve in: Water
DPBS, no calcium no magnesium	Invitrogen	14190136	Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5%	Sigma-Aldrich	S5761 or S8761	Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140163	Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X
Fetal Bovine Serum	Life Technology	Certified	Working Conc.: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml
Dibutyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627	DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	10 mM acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml
Basic FGF	BD Biosciences	354060	Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml