Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода<em> C. Элеганс</em
Summary
Мы продемонстрируем, как использовать технику RNAi кормления, чтобы сбить генов-мишеней и оценка размеров тела фенотип<em> C. Элеганс</em>. Этот метод может быть использован для большого экрана масштаба для выявления потенциальных генетических компонентов интереса, таких как тех, кто участвует в размерах тела регулирования DBL-1/TGF-β сигнализации.
Abstract
Двухцепочечной РНК-опосредованного вмешательства (RNAi) является эффективной стратегией, чтобы сбить цель экспрессии гена 1-3. Это была применена для многих модельных систем, включая растения, беспозвоночных и позвоночных животных. Существуют различные методы для достижения RNAi в естественных 4,5. Например, ген-мишень может быть преобразована в векторе RNAi, а затем постоянно или временно превращаются в клеточные линии, или первичные элементы для достижения эффекта гена нокдаун, можно также синтезировать двунитевых олигонуклеотидов от специфических генов-мишеней (RNAi олигонуклеотиды) может быть временно превращаются в клеточные линии или первичные клетки, чтобы заставить замолчать гены-мишени, или синтезированные двухцепочечной молекулы РНК могут быть микроинъекции в организм. Так как нематоды C. Элеганс используется бактериями как источник пищи, кормление животных с бактериями, выразив двухцепочечной РНК против генов-мишеней обеспечивает жизнеспособную стратегию 6. Здесь мы представляем кормления RNAiМетод забить фенотип размера тела. Размер тела в C. Элеганс регулируется, прежде всего, TGF-β – как лиганд DBL-1, так что этот тест подходит для идентификации TGF-β сигнализации компоненты 7. Мы использовали различные штаммы в том числе два RNAi гиперчувствительной штаммов, чтобы повторить эксперименты RNAi кормления. Наши результаты показали, что СБР-3 штамма дали нам лучшее ожидаемый фенотип RNAi. Метод прост для выполнения, воспроизводимые и легко поддаются количественной оценке. Кроме того, наш протокол сводит к минимуму использование специализированного оборудования, поэтому она подходит для небольших лабораторий или те, в основном студентов учреждений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, мы описываем наш метод для определения размера тела дефектных мутантов C. Элеганс от кормления RNAi. Этот метод применим для выявления TGF-β компоненты сигнализации. Поскольку такие компоненты высоко консервативны в процессе эволюции 15, такие экраны имеют отно?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джеймса Кларка для обеспечения фигурки животных в различные моменты времени развития. C. Элеганс штаммов в этом исследовании, были получены из Caenorhabditis генетический центр, который поддерживается NIH Национальный научно-исследовательский центр ресурсов (NCRR). Эта работа была поддержана CIRG 1817 от CUNY, чтобы JL и CSD, а также путем NIH 1R15GM073678-01 и 1R15GM097692-01 до CSD Мы благодарим д-р Уильям Дж. Райс, д-р Наталья Хольцман, и Мелисса Сильвестрини замечания по рукописи. Эта работа была проведена в частичное выполнение требований к степени кандидата наук в Высшей центра Городского университета Нью-Йорка (С. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
Riferimenti
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
