Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em> C. elegans</em
Summary
Wir zeigen, wie die RNAi Fütterung Technik nutzen, um knock down Zielgene und Gäste Körpergröße Phänotyp<em> C. elegans</em>. Dieses Verfahren könnte für eine großtechnische Bildschirm verwendet werden, um potenzielle genetische Komponenten von Interesse, wie sie beispielsweise in der Körpergröße Regulierung durch DBL-1/TGF-β Signalgebung beteiligt sind.
Abstract
Doppel-Strang-RNA-Interferenz (RNAi) ist eine effektive Strategie, um knock down Zielgenexpression 1-3. Es wurde in viele Modellsysteme einschließlich Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren angewendet worden. Es gibt verschiedene Methoden, um RNAi in vivo 4,5 zu erreichen. Zum Beispiel kann das Ziel-Gen kann in einen RNAi Vektor transformiert werden und dann entweder dauerhaft oder transient in Zelllinien oder primäre Zellen nach Gens Knockdown Effekte zu erzielen transformiert, alternativ synthetisierte doppelsträngige Oligonukleotide aus spezifischer Zielgene (RNAi Oligos) kann transient sein transformiert, in Zelllinien oder primäre Zellen nach Zielgene Schweigen; oder synthetisierten Doppelstrang-RNA-Moleküle können in einen Organismus mikroinjiziert werden. Seit dem Fadenwurm C. elegans verwendet Bakterien als Nahrungsquelle, die Fütterung der Tiere mit Bakterien, die doppelsträngige RNA gegen Zielgene bietet eine tragfähige Strategie 6. Hier präsentieren wir eine RNAi FütterungMethode punkten Körpergröße Phänotyp. Körpergröße in C. elegans primär durch die TGF-β reguliert wird – wie Ligand DBL-1, so dass dieser Assay geeignet ist zur Identifizierung von TGF-β Signalkomponenten 7. Wir verwendeten verschiedene Stämme, darunter zwei RNAi überempfindlich Stämme, die RNAi Fütterungsversuche wiederholen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass rrf-3-Stamm gab uns die besten erwarteten RNAi Phänotyp. Die Methode ist einfach durchzuführen, reproduzierbar und leicht zu quantifizieren. Darüber hinaus minimiert unser Protokoll die Verwendung von Spezialgeräten, so ist es für kleinere Laboratorien oder jenen an überwiegend Bachelor-Institutionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir unsere Methode zur Identifizierung von Körpergröße Defektmutanten von C. elegans durch RNAi Fütterung. Dieses Verfahren ist anwendbar auf die Identifizierung von TGF-β-Signalisierung Komponenten. Da diese Komponenten stark durch Evolution 15 konserviert sind, sind solche Bildschirme relevant zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der TGF-β-Signalisierung in allen Metazoen. Eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung eines solchen Bildschirms ist der Aus…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken James Clark für die Bereitstellung Figuren von Tieren in verschiedenen Entwicklungs-Zeitpunkten. C. elegans-Stämme in dieser Studie wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, das durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) getragen wird erhalten. Diese Arbeit wurde von CIRG 1817 vom CUNY JL und CSD unterstützt und durch NIH 1R15GM073678-01 und 1R15GM097692-01 bis CSD Wir danken Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman und Melissa Silvestrini für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde in teilweiser Erfüllung der Anforderungen für eine Promotion an der Graduate Center der City University of New York (S. Xiong) durchgeführt.
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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