Brug af RNA-medieret Interferens fodringsstrategien at screene for gener involveret i Body Size forordning i Nematode<em> C. elegans</em
Summary
Vi viser, hvordan du bruger RNAi fodring teknik til at vælte målgener og score kropsstørrelse fænotype i<em> C. elegans</em>. Denne metode kunne anvendes til stor skala skærmen for at identificere potentielle genetiske komponenter af interesse, såsom de involveret i kropsstørrelse regulering ved DBL-1/TGF-β signalering.
Abstract
Dobbeltstrenget RNA-medieret interferens (RNAi) er en effektiv strategi til at vælte målgenekspression 1-3. Det er blevet anvendt til mange modelsystemer, herunder planter, invertebrater og vertebrater. Der er forskellige metoder til at opnå RNAi in vivo 4,5. For eksempel kan målgenet omdannes til en RNAi vektor, og derefter enten permanent eller transient omdannes til cellelinier og primære celler til opnåelse gen knockdown virkninger, alternativt syntetiseres dobbelt-oligonukleotider fra specifikke målgener (RNAi oligoer) kan være transient omdannet til cellelinjer eller primære celler til tavshed målrette gener, eller syntetiseres dobbelt-strengede RNA-molekyler kan mikroinjiceres i en organisme. Da nematoden C. elegans bruger bakterier som en fødekilde, fodring af dyrene med bakterier udtrykker dobbelt-strenget RNA mod målgener giver en levedygtig strategi 6. Her præsenterer vi en RNAi fodringFremgangsmåde til at score kropsstørrelse fænotype. Kropsstørrelse i C. elegans reguleres primært af det TGF-β – ligesom ligand DBL-1, så dette assay er egnet til identifikation af TGF-β signalering komponenter 7. Vi brugte forskellige stammer herunder to RNAi hypersensitive stammer at gentage de RNAi fodring eksperimenter. Vores resultater viste, at RRF-3-stammen gav os den bedste forventede RNAi fænotype. Fremgangsmåden er let at udføre, reproducerbar og let kvantificeres. Desuden er vores protokol minimerer brugen af specialiseret udstyr, så det er velegnet til mindre laboratorier eller personer, overvejende bachelor institutioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, beskriver vi vores metode til identifikation af kropsstørrelse mutanter af C. elegans by RNAi fodring. Denne metode anvendes til identifikation af TGF-β signal komponenter. Da sådanne komponenter er stærkt konserverede ved evolution 15, sådanne skærme er relevante for at belyse de molekylære mekanismer af TGF-β-signalering i alle metazoans. En vigtig overvejelse i udformningen af en sådan skærm er den udgangsstamme. Vi har vist, at både ERI-1, lin-15b og <e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker James Clark til tilvejebringelse af tal for dyr på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter. C. elegans stammer i denne undersøgelse blev indhentet fra Caenorhabditis Genetics Center, som er støttet af NIH National Center for Forskning Ressourcer (NCRR). Dette arbejde blev støttet af CIRG 1817 fra CUNY til JL og CSD, og ved NIH 1R15GM073678-01 og 1R15GM097692-01 til CSD Vi takker Dr. William J. Rice, Dr. Nathalia Holtzman, og Melissa Silvestrini om kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev udført i delvis opfyldelse af kravene til en ph.d.-grad fra Graduate Center of the City University of New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
Riferimenti
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
