ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי
Summary
פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.
Abstract
האינטראקציות של מלכודת (גורם oluble N-ethylmaleimide רגיש ceptor מחדש חלבון ttachment ים) חלבונים על שלפוחית (V-מלכודות) ועל קרומי היעד (t-מלכודות) לזרז איחוי שלפוחית תאית 1-4. מבחנים הם חיוניים לכינון מחדש לנתח את מנגנון הוויסות של איחוי המלכודת בתיווך 5. בבדיקת איחוי תאי 6,7, חלבוני מלכודת מתבטאים ectopically בתא השטח. אלה "התהפכו" איחוי כונן מלכודת חלבוני תאי תאים, הוכחה כי מלכודות מספיקות לאיחוי קרום תא. בגלל assay איחוי התאים מתבסס על ניתוח מיקרוסקופי, הוא פחות יעיל כאשר משתמשים בו כדי לנתח מרובה v-ואינטראקציות t-Snare כמותית.
כאן אנו מתארים בדיקה חדשה 8 שמכמתת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז. שניםמרכיבים של מערכת ביטוי גני ט הכבויה 9 משמשים כמערכת readout: טטרציקלין המבוקר transactivator (tta) וכתב פלסמיד שמקודד גן LacZ תחת שליטה של אלמנט טטרציקלין-התגובה (TRE-LacZ). אנו transfect tta לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני v-Snare בתא השטח (V-תאים) וtransfect TRE-LacZ לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני t-Snare בתא השטח (T-תאים) . היתוך מלכודת תלויה של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק של LacZ והביטוי של β-גלקטוזידאז. הפעילות של β-גלקטוזידאז היא לכמת בשיטת colorimetric על ידי ספיגה ב420 ננומטר.
חלבוני קרום שלפוחית הקשורים (VAMPs) הם V-מלכודות שנמצאות בתאים שונים לאחר Golgi שלפוחי 10-15. על ידי בעת 1 VAMPs, 3, 4, 5, 7 ו 8 באותה הרמה, אנו משווים איחויםפעילות באמצעות assay איחוי התאים האנזימטית. מבוסס על מדידת spectrometric, assay זה מציע גישה כמותית לניתוח איחוי מלכודת בתיווך ועל מחקרי תפוקה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay איחוי התאים המקורי 6 קובע אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן אנו מתארים assay חדשני המכמת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז ומדידת spectrometric. שימוש assay זה, אנו שגרתי לנתח 15-20-V ו-T-Snare שילובים יחיד בניסוי. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי קרני הפעלה מהאוניברסיטה לואיוויל וCA135123 מהמכונים הלאומיים לבריאות (לCH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
Riferimenti
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
