Bilaterale Gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader als een adequate Voorconditionering Stimulus naar Early ischemische tolerantie te induceren bij focale ischemie
Summary
Er is een groeiend aantal aanwijzingen, dat ischemische preconditionering (PC) – een niet-schadelijk ischemische uitdaging voor de hersenen – verleent een tijdelijke bescherming aan een volgende schadelijke ischemische schade. Wij opgericht bilaterale gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader (BCCAO) als voorbehandeling stimulans voor vroege ischemische tolerantie (IT) in C57Bl6 / J muizen aanzetten tot voorbijgaande focale cerebrale ischemie (geïnduceerd door midden cerebrale slagader occlusie, MCAO).
Abstract
Er is een groeiend aantal aanwijzingen dat ischemische preconditionering – een niet-schadelijk ischemische uitdaging voor de hersenen – verleent een tijdelijke bescherming aan een volgende schadelijke ischemische schade. We hebben bilaterale arteria carotis communis occlusie opgericht als een voorbehandeling stimulans voor vroege ischemische tolerantie te induceren om voorbijgaande cerebrale ischemie in C57Bl6 / J muizen. In deze video zullen we de gebruikte methodologie voor deze studie tonen.
Introduction
Ischemische beroerte is een ziekte met een hoog sterftecijfer en een enorme socio-economische last 1. Ondanks intensief experimenteel en klinisch wetenschappelijke inspanningen gedurende de afgelopen decennia, opties voor de behandeling acute ischemische beroerte patiënten blijven zeer beperkt 2. In tegenstelling tot dat, zal toenemen van het percentage ouderen in de ontwikkelde landen drastisch te verhogen incidentie en prevalentie van patiënten met een ischemische beroerte in de komende decennia 3. Daarom is er een dringende behoefte aan nieuwe behandelingsstrategieën bij patiënten met een ischemische beroerte.
Een benadering is om verder inzicht in de mechanismen van endogene aanpassing van de hersenen geconfronteerd met een schadelijke stimulus krijgen. Deze hersenen afgeleide neuroprotectie is ook bekend als ischemische voorconditionering (PC) of ischemische tolerantie (IT) en beschrijft een verschijnsel, waarbij een onschadelijke schadelijke prikkel in de hersenen, veroorzaakt een voorbijgaande weerstandtegen een volgende schadelijke ischemisch insult 4. Het komt voor in twee verschillende tijdvensters: begin IT, die optreedt binnen enkele minuten tot enkele uren na PC en vertraagde IT, die een latentie van een paar uur moet plaatsvinden 4.
Tot dusver heeft het onderzoek naar IT in de hersenen gericht op vertraagde IT. Veel minder is bekend over de mechanismen van de vroege IT. Het doel van deze studie is om de bilaterale gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader (BCCAO) dat is een gevestigde stimulans te induceren vertraagde IT, als een adequate PC stimulans te induceren vestigen vroeg IT om voorbijgaande focale cerebrale ischemie (geïnduceerd door midden cerebrale slagader occlusie, MCAO) in C57Bl6 / J muizen.
Tijdens beide chirurgische procedures (BCCAO en MCAO), monitoring van cerebrale doorbloeding (CBF) met laser Doppler flowmetry (LDF) werd uitgevoerd.
BCCAO werd uitgevoerd in verdoofde muizen en spontane ademhaling. Beide gemeenschappelijke halsslagaders (CCA) werden blootgesteldafgedicht en gedurende 60 seconden gevolgd door 5 min reperfusie. Deze BCCAO / reperfusie sequentie werd tweemaal herhaald. Na de operatie, muizen herstelde zich snel en vertoonde geen tekenen van functionele beperking. Om uit te sluiten, dat de BCCAO protocol hierboven beschreven niet resulteren in vertraagde celdood in de hersenen, hebben we een TdT-gemedieerde dUTP-biotine nick end labeling (TUNEL) kleuring 72 uur na BCCAO (of sham operatie) in een aparte groep.
MCAO is een wijd uitgewerkt model voor de inductie van cerebrale ischemie bij knaagdieren 5-7. De chirurgische ingrepen werden uitgevoerd met behulp van gestandaardiseerde operationele procedures (SOP) 8. Na het blootstellen links CCA, werd een siliconen bedekte monofilament geïntroduceerd in de distale CCA, gevorderd via de interne halsslagader (ICA) in de cirkel van Willis totdat de voorste cerebrale slagader (ACA) en daarmee, de oorsprong van de middelste cerebrale slagader ( MCA) werd afgesloten voor een bepaalde periode. In deze studie hebben wegebruik 45 min MCAO, die typisch resulteert in een ischemische laesie op het MCA gebied met striatale en corticale hersengebieden.
In onze studie, analyseerden we de temporele profiel van de vroege IT gebruik BCCAO als de PC stimulus. Onze gegevens blijkt, dat de optimale tijd tussen BCCAO en MCAO vroeg IT is 30 min te induceren.
In deze video zullen we een demonstratie van zowel de chirurgische procedures, dwz BCCAO en MCAO geven.
Protocol
Representative Results
Discussion
In onze studie hebben we aangetoond dat drie reeksen BCCAO van telkens een minuut, gevolgd door reperfusie gedurende vijf minuten, een toereikend ischemische PC stimulus vroeg IT induceren.
Verder hebben we aangetoond dat de voorbehandeling protocol is een veilige en kleine invasieve procedure zonder noemenswaardige postoperatieve morbiditeit, geen tekenen van apoptose in hersenen en geen mortaliteit. Verschillende voorconditionering protocollen zijn eerder beschreven 6-7,12. Ande…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the instrument | Company | Catalogue number/model |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C |
| Light source for microscope | Zeiss | SteREO CL 1500 ECO |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 |
| Stereotactic frame | David Kopf | Model 930 |
| Scissors | FST | 91460-11 |
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 |
| Mircovascular clamp | FST | 00398-02 |
| Clamp applicator | FST | 00072-14 |
| Springscissors | FST | 15372-62 |
| Needle holder | FST | 12010-14 |
| Needles | Feuerstein, Suprama | BER 562-20 |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | |
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | |
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama |
Riferimenti
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Khaja, A. M., Grotta, J. C. Established treatments for acute ischaemic stroke. Lancet. 369, 319-330 (2007).
- Foerch, C., Sitzer, M., Steinmetz, H., Neumann-Haefelin, T. Future demographic trends decrease the proportion of ischemic stroke patients receiving thrombolytic therapy: a call to set-up therapeutic studies in the very old. Stroke. 40, 1900-1902 (2009).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat. Rev. Neurosci. 7, 437-448 (2006).
- Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid cerebral ischemic preconditioning in mice deficient in endothelial and neuronal nitric oxide synthases. Stroke. 34, 1299-1303 (2003).
- Cho, S., et al. Obligatory role of inducible nitric oxide synthase in ischemic preconditioning. J. Cereb. Blood. Flow Metab. 25, 493-501 (2005).
- Kunz, A., et al. Neurovascular protection by ischemic tolerance: role of nitric oxide and reactive oxygen species. J. Neurosci. 27, 7083-7093 (2007).
- Dirnagl, U., et al. Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings. , (2010).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. J. Vis. Exp. (47), e2423 (2011).
- Bederson, J. B., et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Kawano, T., et al. iNOS-derived NO and nox2-derived superoxide confer tolerance to excitotoxic brain injury through peroxynitrite. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1453-1462 (2007).
- Qi, S., et al. Sublethal cerebral ischemia inhibits caspase-3 activation induced by subsequent prolonged ischemia in the C57Black/Crj6 strain mouse. Neurosci. Lett. 315, 133-136 (2001).
- Wu, C., et al. A forebrain ischemic preconditioning model established in C57Black/Crj6 mice. J. Neurosci. Methods. 107, 101-106 (2001).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Nishio, S., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance. Ann. N.Y. Acad. Sci. 890, 26-41 (1999).
- DeBow, S., Colbourne, F. Brain temperature measurement and regulation in awake and freely moving rodents. Methods. 30, 167-171 (2003).
- Colbourne, F., Sutherland, G. R., Auer, R. N. An automated system for regulating brain temperature in awake and freely moving rodents. J. Neurosci. Methods. 67, 185-190 (1996).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?. Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
- Li, L., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning improves short-term and long-term neurological outcome after focal brain ischemia in adult rats. Neuroscienze. 164, 497-506 (2009).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesth. Analg. 96, 233-237 (2003).
- Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J. Neurosci. Methods. 155, 285-290 (2006).
- Zarow, G. J., Karibe, H., States, B. A., Graham, S. H., Weinstein, P. R. Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats: effect of suture insertion distance on cerebral blood flow, infarct distribution and infarct volume. Neurol. Res. 19, 409-416 (1997).
