RNA-seq的凝血酶处理和控制人肺微血管内皮细胞的转录组分析
Summary
该协议提供了一个完整而详细的程序，申请一个功能强大的下一代DNA测序技术，RNA-seq技术，在人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗的个人资料转录。这个协议是一般化到各种细胞或组织中的影响不同的试剂或疾病状态。
Abstract
通过测量细胞中的mRNA水平的基因表达的特征是确定如何转录机制的细 胞受到外部信号（ 如药物治疗），或不同的细胞如何健康状态和疾病状态之间的一个有用的工具。随着新一代DNA测序技术的出现和不断改进，RNA测序（RNA-seq的）已成为越来越受欢迎的转录组分析的方法进行编目所有种类的成绩单，以确定所有基因表达的转录结构和量化的表达水平的变化在一个给定的细胞，组织或生物体1,2的总组转录。 RNA-Seq是逐渐取代DNA微阵列转录组分析的首选方法，因为它有一个完整的转录组分析的优势，提供一个数字型数据（拷贝数的任何誊本），而不是依靠任何已知的基因组sequenCE 3。
在这里，我们提出了一个完整的，详细的协议，适用个人资料转录RNA-seq的人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗。该协议是基于我们最近发表的研究报告，题为“RNA-seq的揭示新型转录的基因及其亚型在人肺微血管内皮细胞凝血酶治疗，”4中，我们成功地完成了第一个完整的人肺微血管内皮细胞的转录组分析与凝血酶使用RNA-seq的治疗。进一步的实验，取得了前所未有的资源，获得洞察的分子机制，凝血酶介导的内皮功能紊乱的炎症性疾病，癌症，糖尿病和冠状动脉心脏疾病的发病机制，并为这些疾病的治疗目标，以提供潜在的新的线索。
此协议的描述性文本被分成四个部分。第一部分介绍了人肺微血管内皮细胞的凝血酶和RNA的提取，质量分析和定量分析的治疗。第二部分介绍了图书馆的建设和测序。第三部分描述了数据分析。第四部分描述的RT-PCR验证试验。显示了有代表性的几个关键步骤的结果。在讨论中提供有用的提示或预防措施，以提高成功的关键步骤。虽然该协议使用人肺微血管内皮细胞用凝血酶，它可以是广义在哺乳动物和非哺乳动物的细胞和组织中具有不同刺激物或抑制剂，或在细胞或组织之间的健康状态来比较转录处理的档案中转录和疾病状态。
Protocol
Representative Results
Discussion
关键步骤
RNA处理核糖核酸酶会降低，即使是最优质的RNA，因此，护理时必须采取相应的隔离，储存和使用的RNA 10。总是戴手套，以防止污染由核糖核酸酶中发现人的手。手套应经常更换，尤其是接触皮肤后，门把手或其他常见的表面。一组吸液管应专门的RNA工作，所有的技巧和管应无RNA酶。 RNA分离和下游的应用程序，应进行低流量区域，常规的RNase-扎普如…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者会喜欢到感谢博士斯蒂芬金斯莫尔和的儿科基因组医学中心儿童慈悲医院和诊所为他们的计算集群为我们的数据分析的，Illumina公司的现场服务团队（伊丽莎白·博耶，斯科特·库克和马克库克）和技术顾问团队，为他们的快速反应和下一代DNA测序仪，HiScanSQ，和数据质量分析的运行有用的建议。这项工作是支持的，部分由美国国立卫生格兰特HL080042（SQY）启动基金和养老的儿童慈善医院和诊所在堪萨斯城，密苏里大学（SQY）。
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
Riferimenti
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
