RNA-seq Analyse van transcriptomen in trombine-behandelde en Control Human Pulmonary microvasculaire endotheelcellen
Summary
Dit protocol geeft een volledige en gedetailleerde procedure voor RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA sequencing technologie, toepassing profiel transcriptomen in menselijke long microvasculaire endotheliale cellen met of zonder behandeling trombine. Dit protocol is generaliseerbaar verschillende cellen of weefsels die door verschillende reagentia of ziekten.
Abstract
De karakterisering van genexpressie in cellen via meting van de mRNA niveaus is een nuttig hulpmiddel bij het bepalen hoe de transcriptionele machinerie van de cel wordt beïnvloed door externe signalen (bijv. behandeling met geneesmiddelen), of hoe cellen verschillen tussen een gezonde toestand en een zieke toestand. Met de komst en continue verfijning van de volgende generatie DNA-sequencing technologie, heeft RNA-sequencing (RNA-seq) uitgegroeid tot een steeds populaire methode van transcriptoom analyse van alle soorten van transcripten in de catalogus van de transcriptionele structuur van alle uitgedrukte genen te bepalen en te kwantificeren de veranderende expressie van het geheel van transcripten in een bepaalde cel, weefsel of organisme 1,2. RNA-seq vervangt geleidelijk DNA microarrays een voorkeurswerkwijze voor transcriptoom omdat het de voordelen van profileren is volledig transcriptoom, die een digitaal type datum (kopienummer van elke transcript) en niet vertrouwen op bekende genomische sequence 3.
Hier presenteren we een volledig en gedetailleerd protocol om RNA-seq van toepassing op het profiel transcriptomen in de menselijke long microvasculaire endotheelcellen met of zonder trombine behandeling. Dit protocol is gebaseerd op recent gepubliceerde studie getiteld "RNA-seq onthult Novel Transcriptome van genen en hun isovormen in menselijke pulmonaire microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine" 4 waarbij we succesvol uitgevoerde eerste volledige transcriptoomanalyse van menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine met RNA-seq. Het leverde ongekende bronnen voor verdere experimenten om inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan trombine gemedieerde endotheel dysfunctie in de pathogenese van inflammatoire aandoeningen, kanker, diabetes en hart-en vaatziekten, en biedt potentiële nieuwe aanknopingspunten voor therapeutische doelen voor deze ziekten.
De beschrijvende tekst van dit protocolis verdeeld in vier delen. Het eerste deel beschrijft de behandeling van menselijke long microvasculaire endotheelcellen met trombine en RNA isolatie, kwaliteit en kwantificering. Het tweede deel beschrijft bibliotheek bouw en sequencing. Het derde deel beschrijft de data-analyse. Het vierde deel beschrijft een RT-PCR-validatie test. Representatieve resultaten van een aantal belangrijke stappen worden weergegeven. Nuttige tips of voorzorgsmaatregelen voor succes in belangrijke stappen te stimuleren worden in de discussie sectie. Hoewel dit protocol gebruikt de menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine kan worden gegeneraliseerd naar profiel transcriptomen in zowel zoogdieren en niet-zoogdiercellen en in weefsels behandeld met verschillende stimuli of inhibitoren of transcriptomen vergelijken in cellen of weefsels van een gezonde toestand en een ziektetoestand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belangrijke stappen
RNA Handling: RNasen zal zelfs degraderen de meest hoogwaardige RNA, dus zorg moet genomen tijdens de isolatie, de opslag en het gebruik van RNA 10 worden. Handschoenen worden altijd gedragen om verontreiniging te voorkomen door RNasen gevonden op de menselijke handen. Handschoenen moeten vaak worden gewijzigd, met name na het aanraken van de huid, deurknoppen en andere gangbare ondergronden. Een set van pipetten dienen uitsluitend gewijd aan het …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Stephen Kingsmore en de Pediatric Genome Medicine Center bedanken Children's Mercy ziekenhuizen en klinieken voor het gebruik van hun computer clusters voor onze data-analyse, Illumina's field service team (Elizabeth Boyer, Scott Cook en Mark Cook) en technische consultant team voor hun snelle reacties en nuttige suggesties over de werking van de volgende generatie DNA-sequencing instrument, HiScanSQ, en kwaliteit van de gegevens-analyse. Dit werk werd mede ondersteund door National Institutes of Health Grant HL080042 (tot SQY) en start-up fonds en begiftiging van Children's Mercy ziekenhuizen en klinieken, Universiteit van Missouri in Kansas City (tot SQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
Riferimenti
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
