RNA-seq Analys av Transcriptomes i trombin behandlade och kontroll Human pulmonell mikrovaskulära endotelceller
Summary
Detta protokoll utgör en fullständig och detaljerad procedur för att tillämpa RNA-seq, en kraftfull nästa generations DNA-sekvensering teknik, profil transcriptomes i humana pulmonära mikrovaskulära endotelceller med eller utan trombin behandling. Detta protokoll är generaliserbara till olika celler eller vävnader som påverkas av olika reagenser eller sjukdomstillstånd.
Abstract
Karakteriseringen av genuttryck i celler via mätning av mRNA-nivåer är ett användbart verktyg för att bestämma hur den transkriptionella maskineriet cellen påverkas av externa signaler (t.ex. läkemedelsbehandling), eller hur celler skiljer mellan ett hälsosamt tillstånd och ett sjukdomstillstånd. Med tillkomsten och kontinuerlig förfining av nästa generations DNA-sekvensering teknik, har RNA-sekvensering (RNA-seq) blivit en alltmer populär metod för transkriptom analys att katalogisera alla arter av transkript, för att bestämma den transkriptionella strukturen för alla uttryckta gener och att kvantifiera de förändrade uttrycksnivåer av den totala uppsättningen av transkript i en given cell, vävnad eller organism 1,2. RNA-seq successivt ersätta DNA microarrays som en föredragen metod för Transkriptomanalys eftersom det har fördelarna med profilering en komplett transkriptom, vilket ger en digital typ nollpunkt (kopia på alla transkript) och inte förlita sig på någon känd genomisk sekventielltce 3.
Här presenterar vi en komplett och detaljerat protokoll tillämpa RNA-seq att profilera transcriptomes i mänskliga lung mikrovaskulära endotelceller med eller utan trombin behandling. Detta protokoll är baserad på vår publicerade nyligen med titeln studien "RNA-seq avslöjar Novel Transcriptome av gener och deras isoformer i mänskliga pulmonell mikrovaskulära endotelceller behandlas med trombin," 4 där vi framgångsrikt utfört den första kompletta transkriptom analys av humana pulmonära mikrovaskulära endotelceller behandlades med trombin med användning av RNA-seq. Det gav oerhörda resurser för ytterligare experiment för att få insikt i molekylära mekanismerna bakom trombinmedierad endoteldysfunktion i patogenesen av inflammatoriska tillstånd, cancer, diabetes och hjärt-kärlsjukdomar, och ger potentiella nya ledare för terapeutiska mål för dessa sjukdomar.
Den beskrivande texten av detta protokollär uppdelad i fyra delar. Den första delen beskriver behandlingen av humana pulmonella mikrovaskulära endotelceller med trombin och RNA-isolering, kvalitet analys och kvantifiering. Den andra delen beskriver bibliotek konstruktion och sekvensering. Den tredje delen beskriver dataanalys. Den fjärde delen beskriver en RT-PCR validering analys. Representativa resultat av flera viktiga steg visas. Användbara tips eller försiktighetsåtgärder för att öka framgång i viktiga steg finns i diskussionsavsnittet. Även detta protokoll använder humana pulmonära mikrovaskulära endotelceller behandlade med trombin, kan det vara generaliseras till profilen transcriptomes i både däggdjurs-och icke-däggdjursceller och i vävnader behandlade med olika stimuli eller inhibitorer, eller att jämföra transcriptomes i celler eller vävnader mellan ett hälsosamt tillstånd och ett sjukdomstillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viktiga steg
RNA Hantering: RNaser försämras även de mest högkvalitativa RNA, därför måste man vara försiktig under isoleringen, lagring och användning av RNA 10. Handskar är alltid användas för att undvika kontaminering av RNaser finns på mänskliga händer. Handskar ska bytas ofta, särskilt efter att röra hud, dörrhandtag och andra gemensamma ytor. En uppsättning pipetter bör ägnas enbart till RNA arbete och alla tips och rör bör RNas-fri. RNA-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Stephen Kingsmore och Pediatric Genome Medicine Center på Barnens Mercy sjukhus och kliniker för användningen av deras datorer kluster för våra dataanalys, Illumina s fältservice team (Elizabeth Boyer, Scott Cook och Mark Cook) och tekniska konsultteam för sina snabba svar och användbara förslag på driften av nästa generations DNA-sekvensering instrument, HiScanSQ och datakvalitet analys. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health Grant HL080042 (till SQY) och startfond och begåvning av barns Mercy sjukhus och kliniker, University of Missouri i Kansas City (till SQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
Riferimenti
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
