El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).
El descubrimiento de la vía de RNAi en eucariotas y el posterior desarrollo de los agentes de ARNi, como siRNA y shRNA, han logrado un método potente para el silenciamiento de genes específicos de 1-8 para la genómica funcional y la terapéutica. Un reto importante involucrado en estudios basados en RNAi es el suministro de agentes de ARNi a células diana. Tradicionales técnicas no víricas de envío, tales como electroporación grandes cantidades y métodos químicos de transfección a menudo carecen del control necesario espacial sobre la entrega y proporcionar eficiencias de transfección 9-12 pobres. Los recientes avances en los métodos de transfección químicas tales como lípidos catiónicos, polímeros catiónicos y nanopartículas han dado lugar a eficiencias de transfección muy mejoradas 13. Sin embargo, estas técnicas aún no ofrecen un control preciso espacial sobre la entrega que se pueden beneficiar inmensamente miniaturizado tecnologías de alto rendimiento, estudios de células individuales y la investigación de las interacciones célula-célula.
nt "> avances tecnológicos recientes en la administración génica han permitido alto rendimiento de transfección de células adherentes 14-23, una mayoría de los cuales utilizan electroporación microescala. electroporación Microscale ofrece espacio-temporal preciso control sobre la entrega (hasta células individuales) y se ha demostrado para lograr altas eficiencias de 19, 24-26. Además, los enfoques basados en la electroporación no requieren un prolongado período de incubación (típicamente de 4 horas) con complejos de DNA y siRNA como sea necesario en los métodos químicos de transfección basados en y conducir a la introducción directa de ADN desnudo y siRNA moléculas en el citoplasma de la célula. Como consecuencia la expresión génica se puede lograr tan pronto como seis horas después de la transfección 27. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de matrices de microelectrodos (MEA) para sitio específico de transfección en cultivos celulares de mamíferos adherentes 17-19. En el enfoque basado en MEA, entrega de carga genética se logra a través de micro-escala localizada electroporatien las células. Una aplicación de pulsos eléctricos a los electrodos seleccionados genera el campo eléctrico local que conduce a la electroporación de células presentes en la región de los electrodos estimulados. El control independiente de los microelectrodos proporciona un control espacial y temporal sobre la transfección y también permite múltiples experimentos de transfección basados en que se realizará en el mismo cultivo aumentando la producción experimental y la reducción de la cultura a la cultura variabilidad.Aquí se describe la configuración experimental y el protocolo para la transfección selectiva de adherentes células HeLa con un siRNA secuencia de marcado con fluorescencia codificado utilizando electroporación. El mismo protocolo también puede ser utilizado para la transfección de vectores de plásmido. Además, el protocolo aquí descrito puede extenderse fácilmente a una variedad de líneas celulares de mamíferos, con modificaciones menores. Disponibilidad comercial de los acuerdos ambientales multilaterales con modelos de electrodos tanto predefinidos y personalizados que este t técnica accesibleo La mayoría de los laboratorios de investigación con equipo básico de cultivo celular.
En este artículo de vídeo que demuestran el uso de MEA para sitio específico de la transfección de células HeLa con revueltos secuencia de siRNA. Una de las ventajas de esta tecnología es su aplicabilidad a diferentes líneas celulares, incluyendo líneas celulares primarias. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de esta tecnología específica de sitio primario de la transfección de cultivo neuronal de hipocampo de rata E18 días de edad y células NIH-3T3 con revueltos secuencias de siRN…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |