عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)
Summary
تفاصيل المقال بروتوكول لمواقع محددة ترنسفكأيشن من مخلوط تسلسل سيرنا في ثقافة خلايا الثدييات تمسكا باستخدام مجموعة ومسرى مكروي (MEA).
Abstract
حققت اكتشاف المسار رني في حقيقيات النوى والتطور اللاحق للعملاء رني، مثل سيرنا وshRNA، وهي طريقة فعالة جدا لإسكات جينات معينة 1-8 لعلم الجينوم الوظيفي والعلاج. ومن التحديات الرئيسية المشاركة في الدراسات القائمة على رني هو تسليم من وكلاء رني إلى الخلايا المستهدفة. التقنيات التقليدية التسليم غير الفيروسية، مثل الصعق الكهربائي ومعظم أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية غالبا ما تفتقر إلى المراقبة الضرورية المكانية على التسليم وتحمل الكفاءة ترنسفكأيشن الفقراء 9-12. وقد أدت التطورات الحديثة في طرائق نقل المواد الكيميائية مثل الدهون الموجبة، والبوليمرات الموجبة والجسيمات النانوية في تعزيز الكفاءة ترنسفكأيشن غاية 13. ومع ذلك، هذه التقنيات لا تزال دون توفر السيطرة المكانية دقيقة على التسليم التي يمكن أن المنمنمة الفئات استفادة هائلة التكنولوجيات الفائقة الإنتاجية والدراسات خلية واحدة من خلايا والتحقيق خلايا التفاعلات.
NT "مكنت> التطورات التكنولوجية الحديثة في إيصال الجينات عالية الإنتاجية ترنسفكأيشن من الخلايا الملتصقة 14-23، أغلبية التي تستخدم الصعق الكهربائي الميكروسكيل. الصعق الكهربائي و يقدم الميكروسكيل دقيقة المكانية والزمانية السيطرة على تسليم (إلى الخلايا واحدة) وتبين أنه لتحقيق الكفاءة العالية 19، 24-26. بالإضافة إلى ذلك، النهج القائم الصعق الكهربائي و لا تحتاج إلى فترة طويلة من الحضانة (عادة 4 ساعات) مع المجمعات سيرنا وDNA عند الضرورة في الطرق الكيميائية ومقرها ترنسفكأيشن يؤدي إلى الدخول المباشر من سيرنا عارية وDNA لا يمكن أن يتحقق في جزيئات الخلية السيتوبلازم. ونتيجة لذلك التعبير الجيني في وقت مبكر من ست ساعات بعد ترنسفكأيشن 27. مختبرنا أظهرت في السابق استخدام صفائف مسرى مكروي (MEA) لمواقع محددة في ترنسفكأيشن تمسكا الثقافات خلايا الثدييات 17-19. في النهج القائم MEA، ويتحقق تسليم حمولة الوراثية عبر electroporati الصغيرة النطاق المترجمةعلى من الخلايا. تطبيق من نبض الكهربائية لأقطاب مختارة يولد المجال الكهربائي المحلي الذي يؤدي إلى الصعق الكهربائي من الخلايا الموجودة في المنطقة من الأقطاب الإلكترونية المبرمجة. مراقبة مستقلة من الأقطاب الكهربائية الدقيقة يوفر السيطرة المكانية والزمانية على ترنسفكأيشن وتمكن أيضا تجارب متعددة ترنسفكأيشن القائمة التي سيتم تنفيذها على نفس الثقافة زيادة الإنتاجية والحد من ثقافة التجريبية إلى ثقافة التنوع.نحن هنا وصف الإعداد التجريبية وبروتوكول لترنسفكأيشن من استهداف خلايا هيلا ملتصقة مع سيرنا الموسومة fluorescently تسلسل باستخدام الصعق الكهربائي و مخلوط. ويمكن أيضا نفس البروتوكول استخدامها لترنسفكأيشن من ناقلات البلازميد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبروتوكول الموصوفة هنا مدد بسهولة إلى مجموعة متنوعة من خطوط خلايا الثدييات مع تعديلات طفيفة. توافر التجارية الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع كل من القطب أنماط محددة مسبقا والعرف جعل هذا الأسلوب للوصول رس مختبرات معظم البحوث الأساسية مع خلية المعدات الثقافة.
Protocol
Discussion
في هذه المقالة نحن الفيديو شرح استخدام MEA لمواقع محددة من خلايا هيلا ترنسفكأيشن مع سيرنا مخلوط تسلسل. واحدة من مزايا هذه التكنولوجيا هو انطباقها على خطوط مختلفة من الخلايا بما في ذلك خطوط الخلايا الأولية. وقد أظهرت مختبرنا سابقا استخدام هذه التكنولوجيا لمواقع محددة ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
Riferimenti
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550 (2002).
- Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).
- Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).
- Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
- Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
- Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
- Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
- Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Efficient and high-throughput electroporation chips. , (2011).
- Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
- Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).
