Het artikel beschrijft de protocol voor plaatsspecifieke transfectie van gecodeerde sequentie van siRNA in een hechtende zoogdiercelkweek met een micro-elektrode array (MEA).
De ontdekking van RNAi pathway in eukaryoten en de daaropvolgende ontwikkeling van RNAi middelen, zoals siRNA en shRNA, hebben een krachtige werkwijze voor silencing specifieke genen 1-8 voor functional genomics and therapeutics. Een belangrijke uitdaging die betrokken zijn bij RNAi gebaseerde studies is de levering van RNAi agenten gerichte cellen. Traditionele niet-virale aflevering technieken, zoals elektroporatie bulk en chemische transfectie methoden vaak niet de vereiste ruimtelijke controle productietijd en 9-12 veroorloven slechte transfectie-efficiëntie. Recente vooruitgang in chemische transfectiewerkwijzen zoals kationische lipiden, kationische polymeren en nanodeeltjes hebben geresulteerd in sterk verbeterde transfectie-efficiëntie 13. Echter, deze technieken nog steeds niet precies ruimtelijke controle over de levering die enorm kunnen profiteren miniatuur high-throughput technologieën, enkele cel studies en onderzoeken van cel-cel interacties aan te bieden.
nt "> Recente technologische ontwikkelingen in gentherapie hebben ingeschakeld high-throughput transfectie van hechtende cellen 14 tot 23, waarvan een meerderheid te gebruiken microschaal elektroporatie. Microscale elektroporatie biedt nauwkeurige spatio-temporele controle over de levering (tot enkele cellen) en is aangetoond Bovendien te bereiken hoge rendementen 19, 24-26., kan elektroporatie benaderingen vereisen een langere incubatietijd (gewoonlijk 4 uur) met siRNA en DNA complexen als noodzakelijk chemische basis transfectiewerkwijzen en leiden tot directe invoer van naakt DNA en siRNA moleculen in de cel cytoplasma. Bijgevolg genexpressie kan worden bereikt al zes uur na transfectie 27. Onze lab eerder het gebruik van micro-elektrode arrays (MEA) voor plaatsspecifieke transfectie in zoogdiercellen hechtende celkweken 17-19 aangetoond. In de MEA aanpak, wordt de levering van genetische lading bereikt via lokale micro-schaal electroporatiop cellen. Een toepassing van elektrische puls om geselecteerde elektroden genereert lokaal elektrisch veld dat leidt tot elektroporatie van cellen in de regio van de gestimuleerde elektrodes. De onafhankelijke controle van de micro-elektroden biedt ruimtelijke en temporele controle transfectie en kunnen meerdere transfectie gebaseerde experimenten worden uitgevoerd op dezelfde cultuur verhogen van de doorvoer en experimentele verminderen cultuur naar cultuur variabiliteit.Hier beschrijven we de experimentele opstelling en het protocol voor gerichte transfectie van het aanklevende HeLa cellen met een fluorescent gelabeld gecodeerde volgorde siRNA met behulp van elektroporatie. Hetzelfde protocol kan ook gebruikt worden voor transfectie van plasmide vectoren. Daarnaast kan de hier beschreven protocol eenvoudig worden uitgebreid om verschillende zoogdiercellijnen met kleine modificaties. Commerciële beschikbaarheid van MEA's met zowel vooraf gedefinieerde en aangepaste elektrode patronen te maken van deze techniek toegankelijk to meest onderzoekslaboratoria met basis celkweek apparatuur.
In deze video artikel tonen we het gebruik van MEA voor plaatsspecifieke transfectie van HeLa cellen met scrambled siRNA sequentie van. Een van de voordelen van deze technologie is de toepasbaarheid van verschillende cellijnen waaronder primaire cellijnen. Onze lab eerder aangetoond dat het gebruik van deze technologie voor plaatsspecifieke transfectie van primaire hippocampale neuronale kweken van E18 dagen oude ratten en NIH-3T3 cellen met scrambled siRNA sequenties en GFP plasmide 18, 19. We hebben ook suc…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |