Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l'aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)
Summary
Les détails article pour le protocole spécifique de site de transfection de siRNA séquence brouillée dans une culture de cellules de mammifères adhérentes à l'aide d'une matrice de micro-électrodes (MEA).
Abstract
La découverte de la voie de RNAi chez les eucaryotes et le développement ultérieur des agents ARNi, comme siRNA et shRNA, ont atteint une méthode puissante pour faire taire des gènes spécifiques 1-8 pour la génomique fonctionnelle et la thérapeutique. Un défi majeur impliqué dans les études basées sur l'ARNi est la délivrance d'agents ARNi dans les cellules ciblées. Les techniques traditionnelles de livraison non viraux, tels que l'électroporation en vrac et les méthodes de transfection chimiques n'ont souvent pas le contrôle nécessaire spatiale sur la livraison et payer des efficacités de transfection pauvres 9-12. Les progrès récents dans les méthodes de transfection chimiques tels que les lipides cationiques, les polymères cationiques et les nanoparticules ont donné lieu à des efficacités de transfection hautement améliorées 13. Toutefois, ces techniques continuent à ne pas offrir un contrôle précis de l'espace au-dessus de livraison qui peut grandement bénéficier miniaturisé technologies à haut débit, des études unicellulaires et les enquêtes sur les interactions cellule-cellule.
nt "> Les récents progrès technologiques dans la prestation des gènes ont permis de transfection à haut débit de cellules adhérentes 14-23, dont une majorité d'utiliser l'électroporation microscopique. électroporation Microscale offre spatio-temporelle précise le contrôle de la livraison (jusqu'à des cellules individuelles) et a été montré d'atteindre des rendements élevés 19, 24-26. De plus, les approches basées sur l'électroporation ne nécessitent pas une longue période d'incubation (environ 4 heures) avec des complexes ADN et de siRNA comme nécessaire dans les méthodes de transfection à base de produits chimiques et de conduire à l'entrée directe de l'ADN nu et siRNA molécules dans le cytoplasme de la cellule. Comme expression d'un gène conséquence peut être atteint dès six heures après la transfection 27. Notre laboratoire a précédemment démontré que l'utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA) pour le site spécifique de transfection dans des cultures de cellules mammaliennes adhérentes 17-19. Dans la MEA approche basée sur la livraison de la charge utile génétique est réalisée via localisée à micro-échelle electroporatisur des cellules. Une application de l'impulsion électrique à des électrodes sélectionnées génère locale du champ électrique qui mène à l'électroporation de cellules présentes dans la zone des électrodes stimulées. Le contrôle indépendant des électrodes de commande fournit des micro-spatiale et temporelle au cours de la transfection et permet également de multiples expériences de transfection à base à effectuer sur la même culture qui augmente le débit et la réduction de culture expérimentale à la variabilité culture.Ici, nous décrivons le dispositif expérimental et le protocole de transfection ciblée des cellules HeLa adhérentes avec une fluorescence marquée brouillés siRNA de séquence en utilisant l'électroporation. Le même protocole peut également être utilisée pour la transfection des vecteurs plasmidiques. En outre, le protocole décrit ici peut être facilement étendu à une variété de lignées cellulaires de mammifères avec des modifications mineures. La disponibilité commerciale de ces accords avec des configurations d'électrodes à la fois prédéfinis et personnalisés font de ce t technique accessiblelaboratoires de recherche avec la plupart des o équipement de culture cellulaire de base.
Protocol
Discussion
Dans cet article, nous démontrons vidéo de l'utilisation de la MEA pour le site spécifique à la transfection de cellules HeLa avec brouillés séquence de siRNA. Un des avantages de cette technologie est son applicabilité à différentes lignées cellulaires, y compris des lignées de cellules primaires. Notre laboratoire a précédemment démontré que l'utilisation de cette technologie pour le site spécifique à la transfection de culture neuronale hippocampique primaire de rat E18 vieux jour et cellules…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
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