Summary

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体(MEA)

Published: September 13, 2012
doi:

Summary

記事の詳細は微小電極アレイ(MEA)を使用して付着した哺乳動物細胞培養におけるsiRNAのスクランブル配列の部位特異的なトランスフェクションするためのプロトコル。

Abstract

このようなsiRNAおよびshRNAなどの真核生物とRNAi剤のその後の開発におけるRNAi経路の発見は、機能ゲノミクスおよび治療 ​​のための特定の遺伝子の1-8を黙らせる強力な方法を実現しました。 RNAiに基づく研究に関与する主な課題は、標的細胞へのRNAiの薬剤の送達である。このようなバルクエレクトロポレーションおよび化学的トランスフェクション法のような従来の非ウイルス送達技術は、多くの場合、配達上必要な空間的制御を欠いており、9月12日貧弱トランスフェクション効率を与える。このようなカチオン性脂質、カチオン性ポリマーとナノ粒子のような化学的トランスフェクション法の最近の進歩は非常に強化されたトランスフェクション効率が13をもたらしました。しかしながら、これらの技術は、まだ非常に小型化されたハイスループット技術、単一細胞研究と細胞間相互作用の調査を受けることができます配信を正確に空間的制御を提供するために失敗する。

ntは"遺伝子送達で>最近の技術の進歩は。接着細胞のハイスループットトランスフェクションの14から23、マイクロエレクトロポレーションを使用しているかの過半数を有効にしたマイクロスケールエレクトロポレーション(最大単セルまで)配達を正確に時空間制御を提供しており、示されている24から26までの高効率19を達成する。さらに、エレクトロポレーションベースのアプローチは、化学ベースのトランスフェクションの方法で必要に応じて、siRNAやDNA複合体とのインキュベーションの長時間(通常4時間)を必要とし、裸の​​siRNAやDNAの直接エントリにつながらない細胞質への分子。結果遺伝子の発現としては、トランスフェクション27後6時間、早ければ達成することができます。私たちのラボは、以前に付着哺乳動物細胞培養17-19にサイト固有のトランスフェクションのための微小電極アレイの使用(MEA)を実証してきました。 MEAベースのアプローチでは、遺伝的ペイロードの配信は、ローカライズされたマイクロスケールelectroporatiを介して実現されるセルの上に。選択された電極への電気パルスの印加は、刺激電極の領域に存在する細胞のエレクトロポレーションにつながる局所的な電界を発生させる。微小電極を独立して制御するには、トランスフェクションオーバー空間的、時間的な制御を提供し、また、同一の培養実験のスループットを向上させ、文化·ツー·文化の変動を減少させる上で実行される複数のトランスフェクションベースの実験を可能にします。

ここでは、実験装置やエレクトロポレーションを用いて蛍光標識スクランブル配列のsiRNAを用いて接着したHeLa細胞の標的とトランスフェクションのためのプロトコルを記述します。同じプロトコルはまた、プラスミドベクターのトランスフェクションのために使用することができます。また、ここで説明されたプロトコルは、簡単にマイナーな修正と哺乳動物細胞株の多様性に拡張することができます。事前定義されたおよびカスタムの両方の電極パターンとMEAの商業的利用は、この手法アクセシブルトンを作る基本的な細胞培養用器材のoほとんどの研究室。

Protocol

1。 MEAの準備以前は18またはそのようなマルチチャンネルシステムとして、MEAメーカーのベンダーから直接購入し説明されているようにエレクトロポレーション実験で使用するためのMEAは、標準のフォトリソグラフィ技術を用いて製造することができる(http:/www.multichannelsystems.com/)とAlpha MED科学株式会社<a href="http://www.med64.com/" …

Discussion

このビデオの記事では、siRNAのスクランブル配列とHeLa細胞の部位特異的なトランスフェクションのためのMEAの使用例を示します。この技術の利点の一つは、主要な細胞株を含む種々の細胞株への適用である。私たちの研究室では以前にE18の日齢のラットおよびスクランブルsiRNA配列とGFPプラスミド18,19とNIH-3T3細胞から主海馬ニューロン培養の部位特異的なトランスフェクションのため…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Cell media:
Advanced MEM
L-Glutamine 200 mM
Penicillin/Streptomycin
Fetal bovine serum
Gibco/Invitrogen
Himedia Laboratories/VWR
Lonza group Ltd.
Gibco/Invitrogen
12492-013
95057-448
09-757F
16000-044
Cell media composition:
2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA Mediatech, Inc. 25-053-CL
PBS Mediatech, Inc. 21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA Qiagen, Inc. 1027292
Electroporation buffer Biorad Laboratories 165-2677
Waveform generator Pragmatic 2414A Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.

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Citazione di questo articolo
Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415, doi:10.3791/4415 (2012).

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