Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme
Summary
Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma sağlar<em> In vivo</em> Deneysel sistemler.
Abstract
Vivo deneysel modellerde olan adaptif bağışıklık inceleyen araştırmacılar için temel bir gereklilik kendi T hücre antijen reseptör (TCR) özgüllük esas T hücreleri belirlemek için bir yetenek. Pek çok dolaylı yöntemlerle T-hücrelerinin bir yığın nüfus belirli bir antijen ile epitopu özgü T hücreleri proliferasyonu, sitokin üretimi, ya da aktivasyonu 1 ifadesi olarak işlevsel bir yanıt ölçümü ile tespit edilir ile in vitro uyarılmış olduğu kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birçok olası fonksiyon gösteren bir epitopuna özgü T hücreleri belirlemek, ve saf haberci frekanslarda epitopa spesifik T hücreleri saptamak için yeterli değildir. Popüler bir alternatif, TCR transjenik adoptif aktarım modeli olan bir TCR transjenik fare monoklonal T hücreleri EASI olabilir epitopa spesifik T-hücrelerinin geniş bir haberci nüfus oluşturmak için histocompatible taşıyıcılara yerleştirildiği tohumlanmıştırly bir congenic işaretleyici antikor 2,3 kullanımı ile izlenir. Güçlü olmakla birlikte, bu yöntem, 4,5, tek bir epitopu için spesifikliğe sahip olan T hücrelerinin unphysiological frekansı ile ilişkili deneysel eser uğrar. Ayrıca, bu sistem, bir poliklonal popülasyon içindeki epitopa spesifik T hücre klonlarının fonksiyonel heterojen araştırmak için kullanılamaz.
MHC (pMHC) kompleksleri: kazanılmış bağışıklık incelemek için ideal bir şekilde sadece kendi akraba peptid bağlayıcı ile TCR özgüllük ayıran bir yöntem kullanılarak, endojen T-hücresi epitopu repertuarından-spesifik T hücrelerinin doğrudan saptanması içermelidir. PMHC tetramerleri ve akış sitometrisi kullanımı bu 6 gerçekleştirir, ancak şu antijen kaynaklı klonal büyüme bulunamadı epitopa spesifik T-hücrelerinin yüksek frekans popülasyonlarının tespiti ile sınırlıdır. Bu protokol, bir pMHC tetramerleri kullanımı ile koordine yöntem ve magnezyum tanımlamaktik hücre zenginleştirme teknoloji fare lenf dokuları 3,7 son derece alçak frekans epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlamaktır. Bu teknik sayesinde, bir kapsamlı immün yanıtın tüm aşamalarında farelerde endojen T hücrelerinin tamamı epitop özel popülasyonlarda izleyebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol tarafından sunulan pMHC tetramer tabanlı cep zenginleştirme yöntemi endojen T hücre çizgilerinden epitop-spesifik T hücreleri incelemek için güçlü bir araçtır. PMHC tetramerleri kullanımı, doğrudan doğruya aynı kökten gelen pMHC ligandlar bağlamak için kendi TCRS yeteneğine dayalı epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlar. Zenginleştirme antijen-spesifik T hücrelerinin çok nadir topluluğunun, genetik ya da haberci frekans herhangi bir düzenlemesi olmadan T hücrelerinin e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi için yardım Jenkins laboratuar Andre Han ve Lawrence Yen teknik yardım ve üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
Riferimenti
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
