In vivo Imaging Systems (IVIS) Påvisning af en neuro-Invasive encephalitiske Virus
Summary
Anvendelse af luciferase og in vivo billeddannelse systemer (IVIS) som et hidtil ukendt middel til at identificere sygdomme endpoints før kliniske udvikling forekommer. IVIS har tilladt os at visualisere i realtid invasionen af encephalitiske vira over flere dage, hvilket giver en mere præcis sygdom model for fremtidige undersøgelser. Det har også givet os mulighed for at identificere de potentielle beskyttende egenskaber af antivirale lægemidler og vacciner hurtigere end aktuelt anvendte dyremodeller. Evnen til at udnytte de enkelte dyr over flere tidspunkter sikrer reducerede dyrenes behov, omkostninger og samlet sygelighed til dyrene udnyttede sikre en mere human og mere videnskabelig hjælp af sygdom undersøgelse.
Abstract
Moderne fremskridt i imaging-teknologi tilskynde til yderligere udvikling og finjustering i den måde viral forskning opnås. Oprindelig blev foreslået af Russel og Burch i Humes 3R (erstatning, begrænsning, forfining), udnyttelse af dyremodeller inden for videnskabelig forskning er under konstant pres for at finde nye metoder til at mindske dyrs forbrug og samtidig forbedre den videnskabelige nøjagtighed og hastighed. En stor udfordring for Humes skoleledere er imidlertid, hvordan man kan sikre undersøgelserne er statistisk præcis samtidig reducere dyresygdom sygelighed og samlede tal. Vaccineeffektivitet undersøgelser øjeblikket kræver et stort antal dyr for at blive betragtet som statistisk signifikant, og resulterer ofte i høj sygelighed og dødelighed endpoints til identifikation af immunbeskyttelse. Vi udnyttet in vivo imaging system (IVIS) i forbindelse med en ildflue bioluminescerende enzym til gradvis spore invasionen af centralnervesystemet (CNS) af en ningphalitic virus i en murin model. Typisk, som sygdommen skrider relativt langsomt, men virusreplikation er hurtig, især i CNS, og kan føre til en ofte dødelig udgang. Efter intranasal infektion af mus med TC83-Luc, modificeret en svækket venezuelansk hesteencefalitis-virus-stamme til udtrykker et luciferasegenet, er vi i stand til at visualisere virusreplikation i hjernen mindst tre dage før udviklingen af kliniske sygdomssymptomer. Udnytte CNS invasion som en central encephalitiske udvikling af sygdom endpoint er vi i stand til hurtigt at identificere terapeutiske og vaccine beskyttelse mod TC83-Luc infektion, før de kliniske symptomer. Med IVIS teknologi er vi i stand til at demonstrere en hurtig og præcis test af narkotika lægemidler og vacciner og samtidig reducere antallet af dyr og sygelighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om denne protokol dækker de billeddannende aspekter til in vivo analyse, er det vigtigt at erkende bioluminescerende vektor som en nøglefaktor for fremtidige undersøgelser. Vores anvendelse af TC83, en svækket vaccinestamme af VEEV, som en vektor til ekspression af luciferase sikrer, at store mængder af enzymet bliver produceret grund af den høje replikationshastighed af virusset i CNS som tidligere beskrevet 1-4. Mens tilsætning af en anden subgenomisk promotor og luciferasegenet resulte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Institut for Translationel Sciences UTMB-NIH tilskud 1UL1RR029876-01 og Alisha Prather for hendes hjælp med videoredigering for dette håndskrift.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
Riferimenti
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
