כמותית סריג ניתוח (תהודת העברת אנרגית פורסטר) לקביעת SENP1 פרוטאז קינטיקס
Summary
שיטה חדשה כרוכה בניתוח כמותי של סריג (העברת אנרגית פורסטר תהודה) אותות מתוארת ללימוד קינטיקה אנזים.<em> K<sub> M</sub</em> ו<em> K<sub> חתול</sub</em> התקבלו להידרוליזה של התחום קטליטי של SENP1 (פרוטאז הספציפי SUMO / Sentrin 1) לטרום SUMO1 (משתנה קטן יוביקוויטין דמוי). העקרונות הכלליים של מחקר הכמותי קינטית-סריג מבוסס פרוטאז יכולים להיות מיושמים על פרוטאזות אחרות.
Abstract
שינויי posttranslational הפיכים של חלבונים עם חלבוני ubiquitin או יוביקוויטין דמויים (Ubls) נמצאים בשימוש נרחב באופן דינמי כדי לווסת את פעילות חלבון ויש תפקידים מגוונים בתהליכים ביולוגיים רבים. לדוגמה, SUMO קוולנטית משנה כמה גדולים או חלבונים עם תפקידים חשובים בתהליכים תאיים רבים, כולל הסדרת מחזור התא, הישרדות תא ומוות, בתגובת ניזק לדנ"א, ומתח תגובת 1-5. SENP, כפרוטאז SUMO ספציפי, מתפקד כendopeptidase בהתבגרות של מבשרי סומו או כisopeptidase להסיר SUMO מחלבוני המטרה שלו ולרענן את מחזור SUMOylation 1,3,6,7.
ההתייעלות או הסגולי הקטליטית של אנזים מאופיינת הטוב ביותר על ידי היחס בין הקבועים קינטיים, יא החתול / K M. בכמה מחקרים, הפרמטרים קינטיים של זוגות SUMO-SENP נקבעו על ידי שיטות שונות, כולל polyacrylamide ג'ל המבוסס על מערב כולו כתם, radioactive כותרתו מצע מתחם, פלורסנט או חלבון מסומן מצע 8-13. עם זאת, טכניקות ג'ל מבוסס polyacrylamide, המשמשות את החלבונים "ילידים", אלא הן מייגעות ותובעני מבחינה טכנית, שאינם מוכן להשאיל את עצמם לניתוח כמוני מפורט. הושג k חתול / K M ממחקרים באמצעות tetrapeptides או חלבונים עם ACC (7-אמינו-4-carbamoylmetylcoumarin) או AMC (7-אמינו-4-methylcoumarin) fluorophore היו או עד שני סדרי גודל נמוך יותר מאשר המצעים הטבעיים או לא יכול להבדיל באופן ברור את ISO ו-פעילויות endopeptidase של SENPs.
מבחני הפרוטאז לאחרונה, סריג מבוססים שמשו כדי לחקור את אנזימי deubiquitinating (dubs) או SENPs עם זוג סריג של חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) 9,10,14,15. היחס בין הפליטה לפליטת acceptor תורם שמש כפרמטר הכמותי לסריג צג אות לפרוטאז activity נחישות. עם זאת, שיטה זו התעלמה-זיהומים צולבי אותות ובאורכי גל פליטת acceptor תורם ידי acceptor ותורם עצמי פלואורסצנטי ולכן לא הייתה מדויק.
פתחנו רומן רגיש מאוד וassay פרוטאז סריג מבוסס כמותית לקביעת הפרמטרים קינטיים של התבגרות מראש SUMO1 ידי SENP1. מהונדס סריג CyPet הזוג וYPet עם יעילות השתפרה באופן משמעותי ותשואת סריג קוונטי קרינה, שמשו כדי ליצור את CyPet-(מראש SUMO1) המצע YPet-16. אנו נבדלים ולכמת אותות קרינה מוחלטים נתרמו על ידי התורם וacceptor וסריג באורכי גל acceptor ופליטה, בהתאמה. הערך של k חתול / K M הושג כ( 3.2 ± 0.55) x10 ז 7 -1 של -1 של SENP1 כיוון-SUMO1 מראש, שהיא בהסכם עם פרמטרים קינטיים אנזימטית כלליים. לכן, שיטה זו הנה בתוקף וניתן להשתמש ביsa בכלל ניגשים לאפיין פרוטאזות אחרות גם כן.
Protocol
Discussion
טכנולוגית הסריג נעשתה שימוש כדי ללמוד ההתבגרות של טרום SUMO1 ידי SENP1 9. CFP-YFP שמש כזוג סריג וניתוח ratiometric, שהוא היחס של acceptor לפליטה התורמת, שמש ללאפיין את התכונות הקינטיות. עם זאת, אין שיקול של תורם וacceptor העצמי פלואורסצנטי בratiometric המסורתי סריג ניתוח. היחס לא לתאם ישירו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מאוד לויקטור GJ רוג'רס לייעוץ רב ערך. אנו מודים לכל חברים בקבוצת ליאו לעבודה משותפת וקרובה מאוד לעזרה במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (גרנט AI076504 לJL).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
Riferimenti
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
