SENP1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なFRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析
Summary
FRETの定量分析（フェルスター共鳴エネルギー転移）信号を含む新規な方法は、酵素反応速度論を研究するために記述されている。<em> K<sub> M</sub</em>と<em> K<sub>猫</sub</em>は（ユビキチン類似因子）プリSUMO1へSENP1（SUMO / Sentrin特異的プロテアーゼ1）の触媒ドメインの加水分解が得られた。この量的-FRETベースプロテアーゼ動態検査の一般的な原理は、他のプロテアーゼに適用することができます。
Abstract
ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（Ubls）を持つタンパク質の可逆的翻訳後修飾は、広く動的にタンパク質の活性を調節し、多くの生物学的プロセスで多様な役割を持っているために使用されます。たとえば、SUMOは共有結合で細胞周期調節、細胞の生存と死、DNA損傷応答、ストレス応答1月5日を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を持つ大規模な番号またはタンパク質を変更します。 SUMO特異的プロテアーゼとしてSENP、SUMO前駆体の成熟にエンドペプチダーゼとして、あるいはその標的タンパク質からSUMOを削除し、SUMO化サイクル1,3,6,7をリフレッシュするイソペプチダーゼとして機能します。
酵素の触媒効率や特異性は、最高の速度定数は、k 猫 / K Mの比であることを特徴とする。いくつかの研究では、SUMO-SENPペアの速度論的パラメータは、RAD、ポリアクリルアミドゲルベースのウェスタンブロットを含む様々な方法によって決定された基板8から13というラベルの付いたioactive標識基質、蛍光化合物またはタンパク質。しかし、 "ネイティブ"のタンパク質を使用しましたが、ポリアクリルアミドゲルベースの技術は、面倒で技術的に厳しいですが、その容易に詳細な定量分析には役立たない。 （7 -アミノ-4 – carbamoylmetylcoumarin）[ACC]またはAMC（7 -アミノ-4 -メチルクマリン）蛍光体でテトラペプチドまたはタンパク質を用いた研究から得られたK 猫 / K M天然の基質よりも低い二桁までのいずれかであったまたは明らかにiso-およびSENPsのエンドペプチダーゼの活動を区別することはできません。
最近では、プロテアーゼアッセイと脱ユビキチン化酵素（ダビング）またはSENPsを勉強するために使用されたベースがFRETは、シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）9,10,14,15のFRETペア。プロテアーゼAC用信号モニタのFRETのドナー発光に対するアクセプター発光の比率は、定量的なパラメータとして使用されましたtivity決定。しかし、この方法では、アクセプターとドナーの自己蛍光によるアクセプターとドナーの発光波長での信号のクロスコンタミネーションを無視し、したがって、正確ではありませんでした。
我々はSENP1によってプリSUMO1成熟の速度論的パラメータを決定するための新規高感度かつ定量的なFRETベースプロテアーゼアッセイを開発しました。工学的には、大幅に改善FRET効率と蛍光量子収率とペアCyPetとYPetのFRET CyPet-（プリSUMO1）YPet基板16を生成するために使用された。私たちは、差別やドナーとアクセプターが寄与するとそれぞれ、アクセプターおよび発光波長でFRETが絶対的な蛍光シグナルを定量化した。 K 猫 / K Mの値は（3.2±0.55）として得た一般的な酵素の速度論的パラメータと一致しているプレSUMO1、向かってSENP1のx10の7 M -1 s -1で 。したがって、この方法は有効であり、使用することができます同様に他のプロテアーゼを特徴付けるためのSAの一般的なアプローチ。
Protocol
Discussion
FRET技術はSENP1 9でプリSUMO1の成熟を 研究するために使用されています。 CFP-YFPは、ドナー·アクセプターへの排出量の比率であるFRETペアとレシオメトリック分析、として使用された速度論的性質を特徴づけるために使用されていました。しかし、伝統的なレシオメトリックでの自己蛍光がFRET分析ドナーとアクセプターのは考慮されていません。比は、直接消化された基質の量と?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、貴重なアドバイスのためにビクターGJロジャースに大変感謝しております。我々は非常に密接な共同作業のために、この研究のヘルプは遼グループのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所（JLにグラントAI076504）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
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