정량은 SENP1 단백 분해 효소 반응 속도론 결정에 대해 (포스터 공명 에너지 전송) 분석 안달
Summary
걱정의 정량 분석 (포스터 공명 에너지 전송) 신호를 포함하는 새로운 방법을 효소 반응 속도론을 연구에 설명되어 있습니다.<em> K<sub> M</sub</em>와<em> K<sub> 고양이</sub</em>은 (작은 Ubiquitin과 같은 수정) 사전 SUMO1에 SENP1 (스모 / Sentrin 특정 단백 분해 효소 1) 촉매 도메인의 가수 분해에 대한 획득했다. 이 양적 – 안달 기반 프로테아제 운동 연구의 일반적인 원리는 다른 프로테아제에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
ubiquitin 또는 ubiquitin 같은 단백질 (Ubls)과 단백질의 치료 posttranslational 수정은 널리 동적으로 단백질의 활동을 조절하고 다양한 생물학적 과정에서 다양한 역할을 수행하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 스모는 covalently 세포주기 조절, 세포 생존과 죽음, DNA 손상 반응 및 스트레스 반응 1-5 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을 갖춘 대형 번호 또는 단백질을 수정합니다. SENP는 스모 특정 단백 분해 효소로, 스모 전구체의 성숙에 endopeptidase 또는 isopeptidase의 기능은 대상 단백질에서 스모를 제거하고 SUMOylation주기에게 1,3,6,7를 새로 고칠 수 있습니다.
효소의 촉매 효율이나 특이성은 가장 운동 상수, K 고양이 / K M의 비율이 특징입니다. 여러 연구에서, 스모 – SENP 쌍의 운동 매개 변수가 힘이에요, polyacrylamide 젤 기반 서양 얼룩 등의 다양한 방법에 의해 결정되었습니다ioactive – 라벨 기판, 형광 화합물 또는 단백질이 기판 8-13를 표시. 그러나, "네이티브"단백질을 사용하지만 polyacrylamide – 젤 기반 기술은 힘든 및 기술적 요구이며, 그 즉시 자세한 정량 분석에 자신을 빌려하지 않습니다. ACC (7 – 아미노-4-carbamoylmetylcoumarin) 또는 AMC (7 – 아미노-4-methylcoumarin) 형광과 tetrapeptides 또는 단백질을 사용하여 연구에서 K 고양이 / K M을 획득 자연 기판보다 크기 낮은 최대 두 명령 중 하나였다 또는 명확하게 SENPs의 ISO와 endopeptidase 활동을 차별화 할 수 없습니다.
최근, 아가야 기반의 단백 분해 효소 assays는 시안 형광 단백질의 걱정 쌍 (CFP)와 황색 형광 단백질 (YFP) 9,10,14,15과 deubiquitinating 효소 (DUBs) 또는 SENPs을 연구하는 데 사용되었습니다. 단백 분해 효소 교류를위한 신호 모니터를 안달을 위해 기증 방출에 대한 수용체 방출의 비율은 양적 매개 변수로 사용되었다tivity 결정. 그러나,이 방법은 수용체 및 공여체 자기 형광하여 수용체와 기증자 방출 파장에서 신호 교차 contaminations을 무시하기 때문에 정확한 아니 었습니다.
우리는 SENP1에 의해 사전 SUMO1 성숙의 운동 매개 변수를 결정하는 매우 중요한 소설 및 정량 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석을 개발했습니다. 엔지니어링은 크게 향상 걱정 효율성과 형광 양자 수율과 쌍 CyPet 및 YPet을 걱정 CyPet – (사전 SUMO1) YPet 기판 16을 생성하는 데 사용되었습니다. 우리는 차별화와 기증자와 수용체에 의해 공헌 각각의 수용체와 방출 파장에서 걱정 절대 형광 신호를 정량화. K 고양이 / K M의 값은 SENP1의 X10 7 M -1의 -1은 일반적으로 효소 운동 매개 변수 계약에 사전 SUMO1 방면 (3.2 ± 0.55)로 얻은 것입니다. 따라서이 방법은 유효하고 사용할 수 있습니다SA 일반적으로는 다른 프로테아제를 특징 접근한다.
Protocol
Discussion
걱정 기술은 SENP1 9 미리 SUMO1의 성숙을 연구하는 데 사용되었습니다. CFP-YFP는 기증자의 배출량에 대한 수용체의 비율입니다 걱정 쌍과 ratiometric 분석으로 사용 된 운동 속성을 특징하는 데 사용되었다. 그러나, 기존의 ratiometric의 자체 형광는 분석을 걱정 기증자와 수용체 전혀 고려가 없습니다. 비율은 직접 소화 기판의 양이 서로 관련이되지 않습니다.
여기 SENP1에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 귀중한 조언 빅터 GJ 로저스 매우 감사하고 있습니다. 우리는 아주 가까운 공동 작업에이 연구에 도움 리아 그룹의 구성원 모두들 감사합니다. 이 연구는 국립 보건원 (JL에 부여 AI076504)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
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