Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analys för SENP1 Proteas Kinetik Fastställande
Summary
Ett nytt förfarande innefattar kvantitativ analys av FRET (Förster resonansenergiöverföring) signaler beskrivs för att studera enzymkinetik.<em> K<sub> M</sub</em> Och<em> K<sub> Katt</sub</em> Erhölls för hydrolysen av den katalytiska domänen av SENP1 (SUMO / Sentrin specifikt proteas 1) att i förväg SUMO1 (små Ubiquitin-liknande modifierare). De allmänna principerna för denna kvantitativa-FRET-baserade proteas kinetiska studier kan tillämpas på andra proteaser.
Abstract
Reversibla posttranslationella modifieringar av proteiner med ubiquitin eller ubikitin-liknande proteiner (Ubls) används ofta för att dynamiskt reglera proteinaktivitet och har olika roller i många biologiska processer. Till exempel, modifierar kovalent SUMO ett stort antal eller proteiner med viktiga roller i många cellulära processer, inklusive cell-cykel reglering, cellöverlevnad och död, DNA-skada respons och stress 1-5. SENP som SUMO-specifikt proteas, till funktioner som en endopeptidas i mognaden av SUMO prekursorer eller som isopeptidase bort SUMO från sina målproteiner och uppdatera SUMOylation cykeln 1,3,6,7.
Den katalytiska effektiviteten eller specificiteten av ett enzym beskrivs bäst av förhållandet mellan kinetiska konstanter, kcat / KM. I flera studier har kinetiska parametrarna för SUMO-SENP par bestämts genom olika metoder, bland annat polyakrylamidgel-baserade western-blot, radIOActive-märkt substrat, fluorescerande förening eller protein märkt substrat 8-13. De polyakrylamid-gel-tekniker, som använde det "ursprungliga" proteiner men är arbetskrävande och tekniskt krävande, inte att inte lätt lämpar sig för detaljerad kvantitativ analys. Den erhållna kcat / K M från studier med tetrapeptider eller proteiner med en ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) eller AMC (7-amino-4-metylkumarin) fluorofor var antingen upp till två storleksordningar lägre än de naturliga substraten eller kan inte klart skilja de iso-och endopeptidas verksamhet SENPs.
Nyligen, FRET-baserade proteas analyser användes för att studera deubiquitinating enzymer (dubs) eller SENPs med FRET-par av cyan fluorescent protein (GFP) och gult fluorescerande protein (YFP) 9,10,14,15. Förhållandet mellan acceptor-utsläpp till donator emission användes som den kvantitativa parametern för FRET signal monitor för proteas acvitet beslutsamhet. Emellertid ignorerade denna metod signal korskontamination på acceptor och donator emissionsvåglängder av acceptor och donator själv fluorescens och därför inte var korrekt.
Vi utvecklade ett nytt mycket känslig och kvantitativ FRET-baserade proteas analys för bestämning av kinetiska parametrarna för pre-SUMO1 mognad med SENP1. Konstruerad FRET par CyPet och YPet med betydligt förbättrad effektivitet FRET och fluorescens kvantutbytet, användes för att alstra CyPet-(före SUMO1)-YPet substratet 16. Vi differentierade och kvantifierade absoluta fluorescenssignaler bidragit med givaren och mottagaren, och FRET på acceptor och emissionsvåglängder, respektive. Värdet av k cat / K M erhölls som (3,2 ± 0,55) mot pre-SUMO1, vilket är i överensstämmelse med de allmänna enzymatiska kinetiska parametrar x10 7 M -1 s -1 av SENP1. Därför är denna metod giltig och kan användas ensa Allmänt förhållningssätt för att karakterisera andra proteaser också.
Protocol
Discussion
FRET teknik har använts för att studera för-SUMO1 s mognad med SENP1 9. GFP-YFP användes som FRET-par och kvotmetriska analyser, vilket är förhållandet mellan acceptom till donator utsläpp, användes för att karakterisera de kinetiska egenskaper. Det finns dock ingen hänsyn till donator och acceptor själv fluorescens i den traditionella kvotmetriska FRET analys. Förhållandet inte direkt korrelerar med mängden digererad substrat.
Här rapporterar vi en utvecklad högk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är mycket tacksamma mot Victor GJ Rodgers för värdefulla råd. Vi tackar alla medlemmar i Liao grupp för mycket nära samarbete arbete och för hjälp med denna studie. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (Grant AI076504 till JL).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
Riferimenti
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
