Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET
Summary
FRET kantitatif analizi (Förster rezonans enerji transferi) sinyalleri içeren bir roman yöntemini enzim kinetiği çalışmaları için tanımlanmıştır.<em> K<sub> M</sub</em> Ve<em> K<sub> Kedi</sub</em> (Küçük ubikitin gibi değiştirici) ön SUMO1 için SENP1 (SUMO / Sentrin belirli proteaz 1) 'in katalitik alanının hidroliz için elde edilmiştir. Bu kantitatif-FRET bazlı proteaz kinetik çalışma genel ilkeler diğer proteazlar için uygulanabilir.
Abstract
Ubikitin veya ubikitin-benzeri proteinler (Ubls) ile proteinlerin tersinir posttranslasyonel değişiklikler yaygın olarak dinamik bir protein aktivitesini düzenleyen ve çok biyolojik olarak farklı roller için kullanılır. Örneğin, SUMO kovalent hücre siklusunun regülasyonunda, hücre yaşam ve ölümü, DNA hasar cevabı ve stres yanıtın 1-5 gibi birçok hücresel süreçlerin önemli rolü olan bir büyük numarası veya proteinleri değiştirir. SENP, SUMO-spesifik proteaz olarak, SUMO öncüllerinin olgunlaşmasının endopeptidazla olarak veya isopeptidase gibi fonksiyonları hedef proteinleri SUMO kaldırmak ve sumoilasyon döngüsü 1,3,6,7 yenilemek için.
Bir enzimin katalitik etkinliği ya da en iyi seçicilik kinetik sabitler, k kedi / K M oranı ile karakterize edilir. Çeşitli çalışmalarda, SUMO-SENP çiftleri kinetik parametreleri rad, poliakrilamid jel tabanlı western-blot dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle tespit edilmiştirioactive-etiketli substrat, floresan bileşik ya da protein alt tabaka 8-13 etiketli. Ancak, "yerli" proteinleri kullanılır ama poliakrilamid-jel tabanlı teknikler, zahmetli ve teknik olarak zor olan, kolayca ayrıntılı nicel analiz için kendilerini borç yoktur. ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ya da AMC (7-amino-4-methylcoumarin) florofor ile tetrapeptides ya da proteinlerin kullanıldığı çalışmalar k kedi / K M edilen doğal substratlar göre büyüklük daha düşük en fazla iki sipariş ya idi veya açıkça SENPs ve iso-ve endopeptidazla faaliyetleri ayırt edemez.
Son zamanlarda, FRET tabanlı bir proteaz deneyleri mavi floresan protein FRET çifti (CFP) ve sarı floresan protein (YFP) 9,10,14,15 ile deubiquitinating enzimler (Dubs) ya da SENPs incelemek için kullanılmıştır. Proteaz ac için sinyal monitör FRET için donör emisyonu alıcı emisyon oranı ölçülebilir bir parametre olarak kullanılmıştırbilirlik belirlenmesi. Bununla birlikte, bu yöntem alıcı ve verici kendi flüoresans ile alıcı ve verici emisyon dalga boyunda çalışan sinyal çapraz bulaşma göz ardı edilir ve böylece doğru değildir.
Bu SENP1 ön-SUMO1 olgunlaşma kinetik parametrelerinin belirlenmesi için bir yeni ve son derece hassas kantitatif FRET bazlı Proteaz analiz geliştirilmiştir. Bir tasarlanmış, önemli ölçüde geliştirilmiş FRET verim ve floresan kuantum verimi ile çift CyPet ve YPet FRET CyPet-(pre-SUMO1)-YPet alt tabaka 16 oluşturmak için kullanılmıştır. Biz farklılaşmış ve verici ve alıcı tarafından katkı ve sırasıyla alıcı ve emisyon dalga boylarında FRET mutlak floresans sinyalleri sayılabilir. K kedi / K M değeri SENP1 x10 7 M -1 s -1 genel enzim kinetik parametreler ile uyum içindedir ön SUMO1, karşı (3.2 ± 0.55) olarak elde edildi. Bu nedenle, bu yöntem geçerlidir ve bir de kullanılabilirsa genel hem de diğer proteazlar karakterize yaklaşım.
Protocol
Discussion
FRET teknoloji SENP1 9 tarafından önceden SUMO1 olgunlaşan incelemek için kullanılmıştır. CFP-YFP, verici ile alıcı emilim oranı olarak FRET çifti ve rasyometrik analizi kullanılmıştır kinetik özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Bununla birlikte, geleneksel rasyometrik içinde kendinden flüoresan analiz FRET verici ve alıcı arasında hiç düşünülmemiştir. Oranı doğrudan sindirilmiş substrat miktarı ile korele değildir.
Burada SENP1 ön…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz değerli tavsiyeler için Victor GJ Rodgers için çok müteşekkiriz. Biz çok yakın ortak çalışma ve bu çalışma ile yardım için Liao grubun tüm üyeleri teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (JL Grant AI076504) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
Riferimenti
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
