Selektiv opsamling af 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA
Summary
Beskrives en totrins-mærkning ved anvendelse β-glucosyltransferase (β-GT) for at overføre et azid-glucose til 5-HMC, efterfulgt af klik kemi til at overføre en biotin linker til nem og densitet-uafhængig berigelse. Denne effektive og specifikke mærkning metode gør det muligt berigelse af 5-HMC med ekstremt lav baggrund og højkapacitetsidentifikation epigenomic kortlægning via næste generation sekventering.
Abstract
5-methylcytosin (5-Mc) udgør ~ 2-8% af de samlede cytosiner i human genomisk DNA og påvirker en lang række biologiske funktioner, herunder genekspression, vedligeholdelse af genom integritet, parentale prægning, X-kromosom inaktivering, regulering af udvikling, aldring og kræft 1. For nylig blev tilstedeværelsen af en oxideret 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), fundet i mammale celler, især i embryostamceller (ES) celler og neuronale celler 2-4. 5-HMC genereres ved oxidationen af 5-mC katalyseret af TET familien jern (II) / α-ketoglutarat-afhængig dioxygenases 2, 3. 5-HMC foreslås at være involveret i vedligeholdelse af embryonale stamceller (MES) celle, normal hæmatopoiese og maligniteter, og zygote udvikling 2, 5-10. For bedre at forstå funktionen af 5-HMC, en pålidelig og enkel sekventering er afgørende. Traditionel bisulfit sekventering kan ikke skelne 5-HMC fra 5-MC 11 </sup>. At optrævle biologi 5-HMC, har vi udviklet en meget effektiv og selektiv kemisk tilgang til at mærke og fange 5-HMC, at drage fordel af en bakteriofag enzym, der tilføjer en glucosedel til 5-HMC specifikt 12.
Her beskriver vi en simpel totrinsprocedure til selektiv kemisk mærkning af 5-HMC. I det første mærkning trin 5-HMC i genomisk DNA mærket med en 6-azid-glucose katalyseret af β-GT, en glucosyltransferase fra T4-bakteriofag på en måde, som overfører 6-azid-glucose til 5-HMC fra modificeret cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andet trin, biotinylering, er en disulfid biotin-linker bundet til azidgruppen af klik kemi. Begge trin er særdeles specifikke og effektive, hvilket fører til fuldstændig mærkning uanset forekomsten af 5-HMC i genomiske regioner og give yderst lav baggrund. Efter biotinylering af 5-HMC, de 5-HMC-holdige DNA-fragmenter derefter selektivt fangetved hjælp af streptavidin-perler i en densitet-uafhængig måde. De resulterende 5-HMC-berigede DNA-fragmenter kan anvendes til efterfølgende analyser, herunder næste generation sekventering.
Vores selektiv mærkning og capture-protokol giver høj følsomhed, der gælder for enhver kilde til genomisk DNA med variable / diverse 5-HMC overflod. Selvom hovedformålet med denne protokol er dens downstream anvendelse (dvs.., Næste generation sekventering at kortlægge 5-HMC distribution i genomet), det er foreneligt med enkelt-molekyle, real-time SMRT (DNA) sekventering, der er kan levere single-base opløsning sekventering af 5-HMC.
Protocol
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) er en nylig identificeret epigenetisk modifikation til stede i væsentlige mængder i visse mammale celletyper. Metoden, der præsenteres her, er til bestemmelse af genom-dækkende udbredelse af 5-HMC. Vi anvender T4 bakteriofag β-glucosyltransferase at overføre en manipuleret glucosedel indeholder en azidgruppe på hydroxylgruppen i 5-HMC. Af azidgruppen kan modificeres kemisk med biotin til påvisning, affinitetsberigelse, og sekventering af 5-HMC-holdige DNA-fragmenter i mammale geno…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet delvist af National Institutes of Health (GM071440 til CH og NS051630/MH076090/MH078972 til PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comment |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |
Riferimenti
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochimica. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
