Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.
5-methylcytosine (5-mC) vormt ~ 2-8% van de totale cytosines in menselijk genomisch DNA en beïnvloedt een breed scala aan biologische functies, inclusief genexpressie, het behoud van de integriteit genoom, ouderlijke imprinting, X-chromosoom inactivatie, regulering van ontwikkeling, de vergrijzing, en kanker 1. Onlangs werd de aanwezigheid van een geoxideerd 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (HMC 5), ontdekt in zoogdiercellen, met name in embryonale stam (ES) cellen en neuronale cellen 2-4. 5-HMC wordt gegenereerd door oxidatie van 5-mC gekatalyseerd door TET familie ijzer (II) / α-ketoglutaraat afhankelijke dioxygenases 2, 3. 5-HMC voorgesteld worden met het onderhoud van embryonale stamcellen (MES) cel, normale hematopoiese en maligniteiten en zygote ontwikkeling 2, 5-10. Om beter te begrijpen van de functie van 5-HMC, een betrouwbare en eenvoudig sequencing is essentieel. Traditionele bisulfiet sequencing kunnen geen onderscheid maken 5-HMC van 5-MC 11 </sup>. Om de biologie van 5-HMC te ontrafelen, hebben we een zeer efficiënte en selectieve chemische benadering van labelen en vast te leggen 5-HMC, gebruik te maken van een bacteriofaag enzym dat een glucose-eenheid draagt bij aan 5-HMC specifiek 12.
Hier beschrijven we een eenvoudige twee stappen voor selectieve chemische labeling van 5-HMC. In de eerste stap labeling wordt 5-HMC in genomisch DNA gelabeld met een 6-azide-glucose gekatalyseerd door β-GT, een glucosyltransferase van T4 bacteriofaag, op een manier die de 6-azide-glucose overdraagt aan HMC 5 van de gemodificeerde cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In de tweede stap biotinylering wordt een disulfide linker biotine aan de azidegroep door klikken chemie. Beide stappen zijn zeer specifiek en efficiënt, waardoor Uitgebreide beschrijving ongeacht de overvloed van 5-HMC in genoomgebieden en geeft zeer lage achtergrond. Na biotinylering van 5-HMC, de 5-HMC bevattende DNA-fragmenten worden vervolgens selectief gevangenmet streptavidine beads in een dichtheid-onafhankelijke manier. De resulterende 5-HMC verrijkte DNA-fragmenten kunnen worden gebruikt voor downstream analyses, met inbegrip volgende generatie sequencing.
Onze selectieve etikettering en capture-protocol verleent een hoge gevoeligheid, van toepassing zijn op elke bron van genomisch DNA met een variabele / diverse 5-HMC abundanties. Hoewel het belangrijkste doel van dit protocol is de downstream toepassing (dat wil zeggen., Next-generation sequencing in kaart te brengen van de 5-HMC distributie in genoom), het is compatibel met single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, dat is kan leveren single-basisresolutie sequencing van 5-HMC.
5-hydroxymethylcytosine (HMC 5) is een recent geïdentificeerde epigenetische modificatie in aanzienlijke hoeveelheden in bepaalde types zoogdiercel. De methode die hier wordt gepresenteerd voor het bepalen van het genoom-brede distributie van 5-HMC. We gebruiken T4 bacteriofaag β-glucosyltransferase een gemanipuleerde glucose rest met een azidegroep op de hydroxylgroep van 5-HMC brengen. De azidegroep kan chemisch worden gemodificeerd met biotine voor de detectie, affiniteitsverrijking en sequencing van 5-HMC bevatten…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Institutes of Health (GM071440 naar CH en NS051630/MH076090/MH078972 naar PJ).
Name | Company | Catalog # | Comment |
Reagents | |||
5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
Streptavidin C1 | |||
Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
Enzyme | |||
β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
Equipment | |||
Sonication device | Covaris | ||
Desktop centrifuge | |||
Water bath | Fisher Scientific | ||
Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |