Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Summary

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Abstract

5-metilcitosina (5-mC) constitui ~ 2-8% das citosinas totais no DNA genómico humano e um impacto de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a expressão de genes, a manutenção da integridade do genoma, a impressão parental, inactivação do cromossoma X, a regulação dos desenvolvimento, envelhecimento, cancro e ^1. Recentemente, na presença de um oxidado 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5 HMC), foi descoberto em células de mamíferos, em particular no estaminais embrionárias (ES) e células neuronais ^2-4. 5 HMC é gerado por oxidação de 5-mC catalisada por TET família de ferro (II) / α-cetoglutarato-dependente dioxigenases ^{2, 3.} 5 HMC é proposto para ser envolvido na manutenção de células estaminais embrionárias (MES), a hematopoiese normal e doenças malignas, e o desenvolvimento do zigoto ^{2, 5-10.} Para melhor compreender a função da 5-HMC, um sistema de sequenciação fiável e simples é essencial. Seqüenciamento bissulfito tradicional não pode distinguir 5 HMC de 5-MC ¹¹ </sup>. Para desvendar a biologia de 5 HMC, temos desenvolvido um método químico altamente eficaz e selectivo para etiquetar e capturar 5 HMC, aproveitando-se de uma enzima de bacteriófago que adiciona uma porção de glucose a 5 HMC especificamente ^12.

Aqui descrevemos um procedimento em duas etapas simples para rotulagem química seletiva de 5-HMC. No passo de rotulagem em primeiro lugar, 5 HMC em ADN genómico é marcado com um catalisada 6-azida-glucose por β-GT, uma glicosiltransferase de bacteriófago T4, de uma maneira que transmite a 6-azida-glucose a 5 HMC do cofactor modificado, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). No segundo passo, biotinilação, de um ligante de biotina de dissulfureto é ligado ao grupo azida por química do clique. Ambos os passos são altamente específicos e eficiente, levando à completa marcação, independentemente da abundância de 5 HMC em regiões genómicas e dando de fundo extremamente baixos. Seguindo a biotinilação de 5 HMC, os fragmentos de 5 HMC contendo ADN são então selectivamente capturadautilizando contas de estreptavidina de um modo independente de densidade. Os fragmentos resultantes de 5 HMC enriquecidas de DNA pode ser utilizado para as análises a jusante, incluindo a última geração de sequenciação.

Nossa marcação selectiva e protocolo de captura confere alta sensibilidade, aplicável a qualquer fonte de DNA genômico com variáveis ​​/ diverso 5 HMC-abundâncias. Embora o objetivo principal deste protocolo é a sua aplicação a jusante (ou seja., Sequenciamento de última geração para mapear a distribuição de 5 HMC no genoma), é compatível com molécula única, em tempo real SMRT (DNA) de seqüenciamento, que é capaz de fornecer uma única base de sequenciação de resolução de 5 HMC.

Protocol

1. A fragmentação de ADN genómico Fragmento de ADN genómico utilizando sonicação de uma gama de tamanhos desejada adequada para a plataforma de sequenciamento do genoma. (Nós normalmente sonicar a ~ 300 pb.) Verificar a distribuição do tamanho do ADN genómico fragmentado em 1% de gel de agarose (Figura 1). 2. Preparação de ADN Determinar as quantidades de ADN a partir baseadas na abundância de 5 HMC em ADN ge…

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5 HMC) é uma modificação do presente recentemente identificado epigenética em quantidades substanciais em certos tipos de células de mamíferos. O método aqui apresentado é para determinar a distribuição de todo o genoma de 5 HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glicosiltransferase para transferir uma porção glucose engenharia contendo um grupo azida para o grupo hidroxilo de 5 HMC. O grupo azida pode ser quimicamente modificados com biotina para a detecção, o enriquecimento por afinidad…

Materials

Name	Company	Catalog #	Comment
			Reagents
5M Sodium chloride (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate	Click Chemistry Tools	A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Column	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipment
Sonication device	Covaris
Desktop centrifuge
Water bath	Fisher Scientific
Gel running apparatus	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Magnetic Separation Stand	Promega	Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).