Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

Summary

Se describe un proceso de etiquetado en dos etapas utilizando β-glucosiltransferasa (β-GT) para transferir una azida-glucosa al 5-HMC, seguido de química para transferir un enlazador de biotina para el enriquecimiento fácil y densidad independiente. Este método de marcaje eficaz y específico permite el enriquecimiento de 5-HMC con fondo extremadamente bajo y de alto rendimiento de mapeo epigenómico a través de secuenciación de próxima generación.

Abstract

5-metilcitosina (5-mC) constituye ~ 2-8% de las citosinas en el total de ADN genómico humano y afecta a una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la expresión génica, el mantenimiento de la integridad del genoma, impronta parental, inactivación del cromosoma X, la regulación de desarrollo, el envejecimiento y el cáncer ^1. Recientemente, la presencia de un oxidó 5-MC, 5-hidroximetilcitosina (HMC-5), fue descubierto en células de mamífero, en particular en madre embrionarias (ES) de células y células neuronales ^2-4. 5-HMC es generada por la oxidación de 5-mC catalizada por TET familia del hierro (II) / α-cetoglutarato dependiente de dioxigenasas ^{2, 3.} 5-HMC es propuesto para que participen en el mantenimiento de la madre embrionarias (ES) de células, la hematopoyesis normal y tumores malignos, y cigoto desarrollo ^{2, 5-10.} Para comprender mejor la función de 5-HMC, un sistema de secuenciación fiable y sencilla es esencial. Secuenciación de bisulfito tradicionales no pueden distinguir 5 HMC de 5-MC ¹¹ </sup>. Para desentrañar la biología de 5-HMC, hemos desarrollado un enfoque químico altamente eficiente y selectiva para marcar y capturar 5-HMC, tomando ventaja de un bacteriófago enzima que añade un resto de glucosa al 5-HMC específicamente ^12.

Aquí se describe un sencillo procedimiento en dos etapas para el etiquetado de productos químicos selectivos de 5-HMC. En la primera etapa de etiquetado, 5-HMC en el ADN genómico se marca con un catalizada 6-azida-glucosa por β-GT, una glucosiltransferasa a partir del bacteriófago T4, de una manera que transfiere el 6-azida-glucosa al 5-HMC de la modificado cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). En la segunda etapa de biotinilación,, un enlazador disulfuro de biotina se une al grupo azida por la química clic. Ambas etapas son altamente específicos y eficiente, llevando a completar el etiquetado independientemente de la abundancia de la 5-HMC en regiones genómicas y dando fondo extremadamente bajo. Después de biotinilación de 5-HMC, los fragmentos de ADN de 5 HMC que contienen son entonces selectivamente capturadoutilizando perlas de estreptavidina de una manera independiente de la densidad. El resultante 5-HMC enriquecidos con fragmentos de ADN se podría utilizar para los análisis posteriores, incluyendo secuenciación de próxima generación.

Nuestra etiquetado selectivo y protocolo de captura confiere una alta sensibilidad, aplicable a cualquier fuente de ADN genómico con variables / diversa 5-HMC abundancias. Aunque el propósito principal de este protocolo es su aplicación aguas abajo (es decir., Secuenciación de próxima generación para mapear la distribución de 5-HMC en el genoma), es compatible con una sola molécula, en tiempo real SMRT (ADN) secuenciación, que es capaz de ofrecer una sola base de secuenciación resolución de 5-HMC.

Protocol

1. Fragmentación de ADN genómico El fragmento de ADN genómico utilizando sonicación a un intervalo de tamaño deseado adecuado para la plataforma de secuenciación de todo el genoma. (Por lo general, sonicar a ~ 300 pb.) Verificar la distribución del tamaño del ADN genómico fragmentado en 1% de gel de agarosa (Figura 1). 2. Preparación de ADN Determinar las cantidades de ADN de partida basado en la abundancia de l…

Discussion

5-hidroximetilcitosina (HMC-5) es un presente identificado recientemente modificación epigenética en cantidades sustanciales en ciertos tipos de células de mamíferos. El método presentado aquí es para determinar la distribución en todo el genoma de la 5-HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glucosiltransferasa para transferir un resto de glucosa de ingeniería que contiene un grupo azida en el grupo hidroxilo de la 5-HMC. El grupo azida se pueden modificar químicamente con biotina para la detección, enriquecimiento d…

Materials

Name	Company	Catalog #	Comment
			Reagents
5M Sodium chloride (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate	Click Chemistry Tools	A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Column	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipment
Sonication device	Covaris
Desktop centrifuge
Water bath	Fisher Scientific
Gel running apparatus	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Magnetic Separation Stand	Promega	Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).