Un indicateur moléculaire de l'adaptation à long terme olfactive dans<em> C. elegans</em
Summary
Nous décrivons ici une lecture moléculaire adaptation à long terme olfactif<em> Caenorhabditis elegans</em>. La protéine kinase G, EGL-4, est nécessaire pour les mesures d'adaptation stables dans la paire de neurone sensoriel primaire appelé AWC. Pendant de longues odeur d'exposition EGL-4 translocation du cytosol vers le noyau de l'AWC.
Abstract
Lors d'une stimulation soutenue des neurones sensoriels les plus adaptera sa réponse en diminuant leur sensibilité au signal. La réponse d'adaptation permet l'attention de forme et protège également les cellules de la sur-stimulation. L'adaptation dans le circuit olfactif de C. elegans a d'abord été décrit par Colbert et Bargmann 1,2. Ici, les auteurs ont défini les paramètres du paradigme d'adaptation olfactive, dont ils se servaient pour concevoir un crible génétique pour isoler des mutants défectueux dans leur capacité à s'adapter aux odeurs volatiles captées par les cellules Wing Amphid de type C (AWC) des neurones sensoriels. Lorsque de type sauvage C. elegans animaux sont exposés à une jolie AWC-senti l'odeur 3 pour 30 minutes, ils vont adapter leur réactivité à l'odeur et ensuite ignorer l'odeur adaptation dans un essai de chimiotaxie comportement pendant ~ 1 heure. Lorsque de type sauvage C. elegans animaux sont exposés à une jolie AWC-senti l'odeur pendant ~ 1 heure ils seront alors ignorer l'odeur adaptation en achemotaxis analyse comportementale pour ~ 3 h. Ces deux phases d'adaptation olfactive chez C. elegans ont été décrits comme adaptation à court terme olfactif (induite après une exposition de 30 min odeur), et adaptation à long terme olfactif (induite après exposition de 60 min odeur). Des travaux ultérieurs de L'Etoile et al., 4 découvert une protéine kinase G (PKG) a appelé EGL-4 qui est nécessaire à la fois pour l'adaptation à court terme et à long terme dans les neurones olfactifs AWC. La EGL-4 protéine contient une séquence de localisation nucléaire qui est nécessaire à long terme des mesures d'adaptation olfactifs, mais dispensable à court terme des mesures d'adaptation olfactifs dans les 4 AWC. Par le marquage EGL-4 avec une protéine fluorescente verte, il était possible de visualiser la localisation de EGL-4 dans l'AWC lors d'une exposition prolongée odeur. L'utilisation de ce entièrement fonctionnel GFP-étiqueté EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécule que nous avons pu développer une lecture moléculaire adaptation à long terme olfactive dans les 5 AWC. L'utilisation de ce mlecture olecular d'adaptation olfactive, nous avons été en mesure d'effectuer les deux écrans avant et arrière génétiques pour identifier les animaux mutants qui présentent des modèles défectueux localisation subcellulaire de la GFP :: EGL-4 dans l'6,7 AWC. Nous décrivons ici: 1) la construction de la GFP :: EGL-4 animaux exprimant; 2) le protocole pour la culture des animaux à long terme analyses de translocation induite par l'odeur nucléaires, et 3) la notation de long terme induite par l'odeur Si la translocation nucléaire et la récupération (re-sensibilisation) de la GFP nucléaire :: EGL-4 Etat.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'entrée des odeurs nucléaire induite d'une GFP-étiqueté EGL-4 molécule décrite ici fournit une lecture solide moléculaire de l'adaptation olfactive chez C. elegans. Les analyses des odeurs provoquées par translocation nucléaire sont simples et ne nécessitent que quelques jours de temps de préparation. L'animal pyIs500 que nous avons construit pour ces essais, exprime un marqueur qui illumine le neurone AWC ainsi que l'expression de la GFP-étiqueté EGL-4 protéines. Ain…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Scott Hamilton, et des membres du laboratoire O'Halloran la lecture attentive de ce manuscrit. Nous remercions également notre relecteur anonyme pour d'excellentes suggestions et commentaires pertinents.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Riferimenti
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