Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema
Summary
Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.
Abstract
Neurone propria interazione glia è fondamentale per funzione fisiologica del sistema nervoso centrale (CNS). La comunicazione bidirezionale è sofisticato mediata da specifiche vie di segnalazione tra neuroni e glia 1,2. Identificazione e caratterizzazione di queste vie di segnalazione è essenziale per la comprensione di come l'interazione neurone a glia forme CNS fisiologia. In precedenza, le colture di neuroni e glia misti sono stati ampiamente utilizzati per il test e la caratterizzazione di vie di segnalazione tra neuroni e glia. Quello che abbiamo imparato da questi preparativi e altri strumenti in vivo, tuttavia, ha suggerito che la segnalazione reciproci tra neuroni e glia sono presentati spesso in settori specifici all'interno dei neuroni (cioè, assoni, dendriti, o soma) 3. Per questo è importante per sviluppare un nuovo sistema di cultura che permette la separazione dei compartimenti neuronali ed esamina in particolare l'interazione tra glia e neuronali assoni / dendriti. Inoltre, il sistema convenzionale coltura mista non è in grado di differenziare i fattori solubili e segnali in membrana di contatto tra neuroni e glia. Inoltre, la grande quantità di neuroni e cellule gliali del convenzionale sistema di co-coltura manca la risoluzione necessaria per osservare l'interazione tra un singolo assone e cellule gliali.
In questo studio, si descrive un assone romanzo e glia sistema di co-coltura con l'uso di una piattaforma microfluidica cultura (MCP). In questo sistema di co-coltura, neuroni e cellule gliali sono coltivati in due camere separate che sono collegati attraverso molteplici canali centrali. In questa piattaforma microfluidica cultura, solo i processi neuronali (soprattutto assoni) può entrare nel lato gliali attraverso i canali centrali. In combinazione con potente etichettatura proteina fluorescente, questo sistema permette esame diretto di percorsi di segnalazione tra interazioni assonali / dendritiche e gliali, tales assone-mediata regolazione trascrizionale nelle cellule gliali, glia-mediata traffico recettore in terminali neuronali e glia-mediata della crescita degli assoni. Il diametro ridotto della camera vieta anche significativamente il flusso del neurone arricchito medio nella camera gliale, facilitando sondaggio della diretta membrana-proteina tra assoni / dendriti e superfici gliali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il neurone MCP based e astrociti co-coltura sistema consente di dissezione neurone dettagliata astroglia vie di segnalazione permettendo solo gli assoni passare i canali centrali e interagire con le cellule astrogliali. Questo co-coltura sistema può essere comodamente impostato con neurone convenzionale e procedure di coltura astrociti. Abbiamo anche descritto un applicazione pratica di questo sistema di co-coltura con l'impiego di un reporter eGFP based per dimostrare assone-dipendente attivazione promotore GLT1 n…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dott. Jeffrey Rothstein per la fornitura di BAC GLT1 topi eGFP e GLT1 anticorpi; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) per la fornitura di servizi di base preziosi, New facoltà di assunzione di assegnazione (NIH 5P30NS069254 P30-02 , PI, Phil Haydon) in Tufts Neuroscienze Dipartimento.
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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Neuron culture medium for plating cell
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Astrocyte culture medium
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Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
Riferimenti
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