Descriviamo un test diagnostico prezioso che potrebbe potenzialmente essere utilizzato per decidere il ritiro di immunosoppressione dopo trapianto senza elevato rischio di rigetto del trapianto. Il test utilizza i principi di ipersensibilità di tipo ritardato e fornisce una valutazione accurata del donatore risposte immunitarie effettrici e normativi specifici montati dai destinatari.
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Articolo metodologico
Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Risposta di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è un rapido in manifestazione in vivo della risposta immunitaria delle cellule T-dipendente ad un antigene estraneo (Ag), che il sistema immunitario ospite ha sperimentato nel recente passato. Reazioni DTH sono spesso divisi in una fase di sensibilizzazione, riferendosi all'esperienza iniziale antigene, e una fase sfida, che segue solitamente parecchi giorni dopo la sensibilizzazione. La mancanza di una risposta di ipersensibilità di tipo ritardato per un richiamo Ag dimostrato da test cutaneo è spesso considerato come una prova di anergia. Il dosaggio DTH tradizionale è stato usato efficacemente nel diagnosticare infezioni microbiche molti.
Nonostante la condivisione funzioni immunitarie simili come infiltrazione linfocitaria, edema e necrosi tissutale, il DTH diretto non è una tecnica diagnostica fattibile in pazienti trapiantati causa della possibilità di iniezione diretta conseguente sensibilizzazione ad antigeni donatori e perdita del trapianto. Per evitare questo problema, il ronziouno-a-mouse "trans-vivo" test DTH è stato sviluppato 1,2. Questo test è essenzialmente un trasferimento di test DTH, in cui il sangue cellule umane mononucleate periferiche (PBMC) e gli antigeni specifici sono stati iniettati per via sottocutanea nei padiglioni auricolari o zampa di un topo ingenua e DTH-come gonfiore viene misurata dopo 18-24 ore 3. La presentazione dell'antigene da cellule presentanti l'antigene umano come i macrofagi o DCS a cellule T nei tessuti altamente vascolare del mouse attiva la cascata infiammatoria e attrae le cellule immunitarie del mouse con conseguente risposte gonfiore. La risposta è antigene-specifici e richiede preventiva antigene sensibilizzazione. Una risposta DTH donatore-reattiva positiva nel test Tv-DTH riflette che il paziente trapiantato ha sviluppato una disposizione immunitaria pro-infiammatoria verso alloantigeni innesto.
La caratteristica più importante di questo saggio è che può anche essere utilizzato per rilevare le cellule T regolatorie, che causano la soppressione astanti. Soppressione di un astanteDTH risposta richiamo alla presenza di antigeni del donatore è caratteristica di trapianto di rene-accettati 2,4-14. Il monitoraggio dei pazienti trapiantati per alloreattività e regolazione con Tv-DTH può identificare un sottogruppo di pazienti che potrebbero trarre beneficio dalla riduzione di immunosoppressione senza elevato rischio di rigetto o di deterioramento della funzione renale.
Un'area promettente è l'applicazione del saggio Tv-DTH nel monitoraggio di autoimmunità 15,16 e anche in immunologia tumorale 17.
Protocollo
1. Preparazione di linfociti
- Prelevare il sangue in (acido citrato destrosio) tubi di ACD.
- Isolare PBMC da sangue periferico umano fresco utilizzando linfociti di separazione medio secondo metodi standard.
- Lavare le PBMC tre volte con PBS per rimuovere le piastrine contaminanti. Le piastrine sono risultati interferire con test DTH trans-vivo. Massima ammissibile di contaminazione delle piastrine di preparazione PBMC è ≤ 1x10 7 / iniezione.
- Se vi è una contaminazione del globulo rosso evidente, lisi dei globuli rossi utilizzando tampone di lisi ACK dopo primo lavaggio. Rimuovere il tampone ACK lavando due volte con P....
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Risultati
1. Valutazione del trapianto di rene per la risposta antigene-specifica donatore utilizzando test Tv-DTH
Per testare il donatore-reattiva immunità cellulare nel trapianto di rene abbiamo iniettato PBMC di questi pazienti con antigeni del donatore da soli o con un richiamo antigene tossoide tetanico (TT). Come i pozzetti di controllo positivo sono stati iniettati con sola TT. Osserviamo tre modelli principali di ipersensibilità di tipo ritardato nei pazienti trapiantati (Figura 1).
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Discussione
Il saggio DTH trans-vivo è un test diagnostico romanzo con un potenziale applicazione clinica nella valutazione risposte mediate da cellule nel trapianto, cancro e pazienti autoimmuni. E 'prezioso perché non solo è utile nel monitoraggio delle risposte effettrici richiamo T, ma anche in grado di rilevare le risposte T regolatorie. Un modo affidabile per rilevare regolamento DTH umano potrebbe predire la sicurezza di recesso dell'immunosoppressione in pazienti che sono candidati per studi clinici in monoterapia o.......
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Dichiarazioni
Gli autori di questo manoscritto non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere i contributi di AM VanBuskirk allo sviluppo della nostra comprensione della risposta DTH regolamentato nei destinatari del trapianto. Questo lavoro è stato supportato sovvenzioni NIH PO1AI084853 e R01AI066219-06, e dalla UE sponsorizzato uno studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo ACD per il prelievo del sangue | BD | 02-684-26 | |
| Mezzo per la separazione dei linfociti | Cellgro | 25-072-CV | |
| Soluzione salina fosfato di Dulbecco | Cellgro | 21-031-CM | Senza calcio &e magnesio |
| Buffer di lisi ACK | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT o EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/iniezione EBV 8 μg/iniezione | |
| Inibitore delle proteasi PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosina per il conteggio cellulare | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigene | Antigeni HLA purificati, peptidi allotipici sintetici possono essere utilizzati al posto di lisati cellulari donatori privi di cellule | ||
| tubi da centrifuga sterili da 50 ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Pipette da 10 ml e pipettatore | BD Falcon | 13-675-20 | |
| tubi con chiusura di sicurezza da 2 ml | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μpipette con punte sterili | |||
| Emocitometro | Fisher | 02-671-10 | |
| Centrifuga a grandezza naturale e microcentrifuga | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| Siringhe per insulina da 1/2 cc o da 1 cc | Becton Dickinson | 14-826-79 | ago da 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | sonda da 2 mm | |
| Calibro di spessore per diaframmi | Mitutoyo, Giappone | ||
| topi SCID | Harlan | ||
| Isoflurano | Piramal Healthcare | Anestesia inalatoria |
Riferimenti
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106
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Ristampe e permessi
