HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

Summary

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine.

Abstract

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine. Cellules souches embryonnaires humaines sont des artefacts de la culture cellulaire, et ont tendance à acquérir anomalies chromosomiques avec doublements de population élevée. Repiquage correcte est essentielle pour maintenir une bonne santé, indifférenciée, des teintes caryotype humain normal de la culture de cellules souches embryonnaires. Tout d'abord, une culture de l'expansion est lavé dans du PBS pour éliminer les médias résiduelles et les débris cellulaires, puis les cellules sont recouvertes avec un volume minimal de 0,05% au chaud trypsine-EDTA. La trypsine est à gauche sur les cellules pour un maximum de cinq minutes, puis les cellules sont doucement délogés avec une pipette de 2 mL sérologique. La suspension cellulaire est recueilli et mélangé avec un volume important de médias teintes, puis les cellules sont collectées par centrifugation douce. La trypsine inactivé média mélange est éliminé et les cellules remises en suspension dans les médias HUES préchauffé. Un rapport de division appropriée est calculé (généralement 1:10-1:20), et les cellules re-plaqué sur une plaque 1-2 jours anciens contenant une monocouche de cellules embryonnaires de souris irradiées alimentation fibroblastes. La plaque de culture nouvellement ensemencé HUES n'est laissé au repos pendant 48 heures, puis les médias est changé tous les jours par la suite. Il est important de ne pas trpsinize jusqu'à une suspension cellulaire unique, car cela augmente le risque d'introduction d'anomalies chromosomiques.

Protocol

Général Nous vous recommandons de dégel pas plus d'un échantillon à un moment donné pour assurer une manipulation facile. Le gestionnaire doit prendre soin de ne pas laisser des cultures à la température ambiante et de faibles émissions de CO2 pendant de longues périodes de temps. Tous centrifugation des cellules vivantes se fait à 500-600 g pendant 5 min à température ambiante. FAE (cellules de souris embryonnaires Feeder) Préchauffer …

Discussion

Dans cette vidéo, nous avons démontré comment nous HUES passage couramment lignées de cellules souches dans notre laboratoire. Fractionnement efficace et régulière et repiquage est essentiel pour maintenir une bonne santé humaine ligne de cellules souches embryonnaires. Passage de la médiation trypsine est un avantage significatif de teintes des lignées de cellules, cependant, il est important de ne pas trop trypsiniser cultures ou d'avoir une grande proportion de cellules individuelles pendant le re-Platting.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml