Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

Summary

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin.

Abstract

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin. Menschliche embryonale Stammzellen sind Artefakte der Zellkultur, und neigen dazu, karyotypischen Anomalien mit hoher Populationsverdopplungen erwerben. Proper Passagieren ist essentiell für die Aufrechterhaltung einer gesunden, undifferenziert, karyotypisch normalen FARBEN menschlichen embryonalen Stammzellen Kultur. Erstens, eine expandierende Kultur in PBS gewaschen, um restliches Medium und Zelltrümmer zu entfernen, dann Zellen werden mit einem minimalen Volumen von warmen 0,05% Trypsin-EDTA überlagert. Trypsin auf die Zellen für bis zu fünf Minuten nach links, dann Zellen werden vorsichtig mit einer 2-ml-serologischen Pipette verdrängt. Die Zellsuspension gesammelt und mit einem großen Volumen von Farbtönen Medien vermischt, dann Zellen werden durch sanfte Zentrifugation gesammelt. Das inaktivierte Trypsin Medien Gemisch entfernt und die Zellen in vorgewärmten FARBEN Medien resuspendiert. Eine entsprechende Teilungsverhältnis wird berechnet (in der Regel von 1.10 bis 01.20 Uhr), und die Zellen auf eine 1-2 Tage alten Platte mit einer Monoschicht von bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten-Feeder-Zellen re-vernickelt. Die neu ausgesät FARBEN Kultur Platte links ungestört ist für 48 Uhr, dann werden die Medien wird jeden Tag danach. Es ist wichtig, nicht zu trpsinize auf eine einzige Zellsuspension, wie dies erhöht die Gefahr der Einschleppung von karyotypischen Anomalien.

Protocol

General Wir empfehlen dem Auftauen nicht mehr als eine Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt auf eine einfache Handhabung zu gewährleisten. Der Hundeführer sollte darauf achten, dass Kulturen bei Raumtemperatur und niedrigen CO2-Urlaub für längere Zeit. Alle Zentrifugation von lebenden Zellen ist bei 500-600 xg für 5 min bei Raumtemperatur. MEFs (embryonalen Feeder-Zellen) Pre-warm MEF Medien bis 37 ° C. Entfernen Sie MEF Fläschchen von -80 ° C und…

Discussion

In diesem Video demonstriert, wie wir routinemäßig Durchgang FARBEN humanen embryonalen Stammzelllinien in unserem Labor. Effiziente und regelmäßige Aufteilung und Passagieren ist essentiell für die Aufrechterhaltung einer gesunden menschlichen embryonalen Stammzell-Linie. Trypsin-vermittelten Passage ist ein wesentlicher Vorteil von Farbtönen Zelllinien, ist es jedoch wichtig, nicht über trypsinize Kulturen oder zu einem großen Anteil der einzelnen Zellen während des Wiedereintritts Flechten haben.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml