HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Summary

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

Abstract

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina. Células madre embrionarias humanas son artefactos de cultivo celular, y tienden a adquirir las anomalías del cariotipo con duplicaciones de población. Pases adecuada es esencial para el mantenimiento de una sana, las tonalidades diferenciadas, cariotipo normal de madre humanas embrionarias cultivo de células. En primer lugar, una cultura en expansión se lava con PBS para eliminar los medios de comunicación residuales y los desechos celulares, y luego las células se cubren con un volumen mínimo de agua tibia 0,05% de tripsina-EDTA. Tripsina se deja en las células durante un máximo de cinco minutos, luego las células se desprendió suavemente con una pipeta serológica 2 ml. La suspensión celular se recoge y se mezcla con una gran cantidad de medios tonos, y luego las células se recogieron por centrifugación suave. La mezcla de los medios de comunicación inactiva la tripsina se elimina, y las células se resuspendieron en pre-calentado los medios tonos. Una relación de separación adecuada se calcula (en general, 1:10-01:20), y las células re-chapada en una placa de 1-2 días de edad que contiene una monocapa de células embrionarias de ratones irradiados fibroblastos de alimentación. La placa recién sembrado HUES la cultura se deja en reposo durante 48 horas, entonces el medio se cambia todos los días a partir de entonces. Es importante no trpsinize hasta una suspensión de células individuales, ya que esto aumenta el riesgo de introducir alteraciones del cariotipo.

Protocol

General Se recomienda descongelar no más de una muestra en un momento dado para facilitar la manipulación. El operario debe tener cuidado de no dejar a temperatura ambiente, las culturas y las bajas emisiones de CO2 durante largos períodos de tiempo. Todos los centrifugación de las células vivas se realiza a 500-600 g durante 5 min a temperatura ambiente. MEFs (células embrionarias de ratón alimentador) Pre-caliente el MEF los medios de comunicaci…

Discussion

En este vídeo se demuestra la forma en que habitualmente HUES paso humano líneas de células madre embrionarias en nuestro laboratorio. División eficaz y regular y pases es esencial para mantener un saludable humano línea de células madre embrionarias. Paso de la tripsina mediada es una ventaja significativa de las líneas de células HUES, sin embargo, es importante no trypsinize sobre las culturas o de tener una gran proporción de células individuales durante la re-lotificación.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml