Endotelin-1 inducerad Middle cerebral artärocklusion modell för ischemisk stroke med laser Doppler Flowmetry Vägledning i råtta

Summary

Flera djurmodeller av cerebral ischemi har utvecklats för att simulera det mänskliga tillståndet av stroke. Detta protokoll beskriver endotelin-1 (ET-1) inducerad mellersta cerebral artärocklusion (MCAO)-modell för ischemisk stroke hos råttor. Dessutom, är viktiga överväganden, fördelar och brister i denna modell diskuteras.

Abstract

Stroke är den främsta orsaken till funktionshinder och tredje vanligaste dödsorsaken i världen, kostar uppskattningsvis $ 70 miljarder USA under 2009 ^{1, 2.} Flera modeller av cerebral ischemi har utvecklats för att efterlikna det mänskliga tillståndet av stroke. Det har föreslagits att upp till 80% av alla slag beror på ischemisk skada i den mellersta cerebrala artären (MCA) område ^3. I början av 1990-talet, ⁴ endotelin-1 (ET-1) användes för att inducera ischemi genom att tillämpa det direkt intill ytan av MCA efter kraniotomi. Senare blev denna modell modifierades ⁵ genom användning av en stereotaxisk injektion av ET-1 intill MCA att producera fokal cerebral ischemi. De främsta fördelarna med denna modell är förmågan att utföra proceduren snabbt, förmågan att kontrollera artär sammandragning genom att ändra dosen av ET-1 levereras, utan att behöva manipulera extra-fartyg som levererar blod till hjärnan och gradvis reperfusipå räntor som närmare efterliknar reperfusion hos människor ^5-7. Å andra sidan, har ET-1-modellen nackdelar som inkluderar behovet av en kraniotomi, liksom högre variabilitet i slagvolymen ^8. Denna variation kan reduceras med användning av laser-Doppler flowmetry (LDF) kontrollera cerebral ischemi under ET-1-infusion. Faktorer som påverkar stroke variabilitet inkluderar precision infusion och satsen av ET-1 som används ^6. En annan viktig faktor är att även om reperfusion är vanligt förekommande i människans stroke kan varaktigheten av ocklusion för ET-1-inducerad MCAO inte nära efterliknar det mänskliga slag där många patienter har delvis reperfusion under en period av timmar till dagar efter ocklusion ^{9, 10.} Detta protokoll kommer att i detalj beskriva ET-1-inducerad MCAO modell för ischemisk stroke hos råttor. Det kommer också att uppmärksamma särskilda överväganden och eventuella nackdelar under hela förfarandet.

Protocol

Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Florida och är i överensstämmelse med "Guide för vård och användning av försöksdjur" (åttonde upplagan, National Academy of Sciences, 2011). Material Djur: Åtta veckor gamla, manlig, Sprague Dawley-råttor (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) vägande 250-300 g vid tidpunkten för operation. Anestesi Inhalationsanes…

Representative Results

1. Post-op neurologisk utvärdering Efter djuret återfår medvetandet, kan en mängd olika tester för att utvärdera neurologiska underskott, inklusive balans, greppstyrka, tass placering, postural asymmetri och trappa klättring. Den solrosfrön uppgift är en grov bedömning av motoriska och sensoriska funktioner som har signifikant korrelation med infarktvolymen 7, 12. Under denna uppgift är råttor tidsinställda när du öppnar och konsumera 5 solrosfrön. De fem frön placer…

Discussion

ET-1-inducerad MCAO är en etablerad modell för experimentell ischemisk stroke som regelbundet används i flera råtta stammar. Många variabler, såsom råtta stam, djur ålder, kroppstemperatur, anestesi metod och operatör expertis kan leda till ökad variation i infarkt volymer vid användning av denna modell ^{5, 14.} Men flera forskare visat att fördelarna med denna modell inkluderar relativt icke-invasiv metod, dos-respons av cerebralt blodflöde till ET-1, och förmåga att undvika anestesi helt genom…

Materials

Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery. Anesthesia Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA) Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA) Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) Small animal stereotaxic system Non-rupture ear bars for rats Gas anesthesia head holder for rats Temperature regulation BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA) Surgical instruments Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA) Surgical Supplies Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA) Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA) 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA) Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA) Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA) Chemicals Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA) Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA) Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA) Visualization Equipment Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA) Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA) Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA) Standard Pencil Probe Probe holder Blood FlowMeter Powerlab 4/30 with LabChart 7 Measurement of infarct volume Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA) 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA) Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)