Enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (SSC) dans la culture de dérivation de long terme Lines adultes CSE de souris

Summary

Une méthode simple pour obtenir et maintenir la tige spermatogonies et des lignées de cellules souches de souris adultes est présenté ici. La méthode utilise des cellules nourricières en provenance du compartiment des cellules somatiques du testicule de souris adultes. Cette technique est applicable à des souches de souris communes, y compris transgénique, knock-out, et souris knock-in.

Abstract

Spermatogonies souches et des cellules progénitrices (CSP) du testicule représentent un exemple classique de cellules souches adultes de mammifères et préserver la fertilité de près la vie de l'animal. Bien que les mécanismes précis qui régissent l'auto-renouvellement et la différenciation in vivo sont difficiles à l'étude, différents systèmes ont été développés précédemment pour propager SSC murins in vitro en utilisant une combinaison de milieux de culture spécialisées et cellules nourricières ^1-3.

Dans la plupart des incursions in vitro sur la biologie des SSC ont dérivé des lignées de cellules de nouveau-nés, probablement en raison de la difficulté d'obtenir des lignées de cellules adultes ^4. Toutefois, le testicule continue d'évoluer jusqu'à environ 5 semaines d'âge dans la plupart des souches de souris. Au début des années période post-natale, des changements dramatiques se produisent dans l'architecture du testicule et de la biologie à la fois somatique et les cellules spermatiques, y compris les changements dans les niveaux d'expression de cellules souches multiples liésgènes. Par conséquent, la période néonatale lignées dérivées de CSE ne peut pas totalement récapituler la biologie des SSC adultes qui persistent après le testicule adulte a atteint un état d'équilibre.

Plusieurs facteurs ont entravé la production de lignées de CSE adultes historiquement. Tout d'abord, la proportion de cellules souches fonctionnelles peuvent diminuer pendant l'âge adulte, soit en raison de facteurs intrinsèques ou extrinsèques ^5,6. En outre, comme avec d'autres cellules souches adultes, il a été difficile pour enrichir SSC suffisamment partir de cellules adultes au total des testicules sans l'aide d'une combinaison de stratégies de tri immunosélection ou autres ^7. Stratégies couramment utilisées comprennent l'utilisation de souris cryptorchides comme source de cellules du donneur en raison d'un ratio plus élevé de cellules souches à d'autres types cellulaires ^8. Sur la base de l'hypothèse que l'élimination des cellules somatiques de la culture initiale perturbe les interactions avec la niche de cellules souches qui sont essentiels pour la survie SSC, nous avons déjà développé des méthodes pour calculer l adulteines qui ne nécessitent pas immunosélection ou des donateurs cryptorchides mais plutôt employer l'enrichissement de série des SSC de la culture, ci-après dénommés SESC ^2,3.

La méthode décrite ci-dessous implique une procédure simple pour dériver adultes lignes SSC en dissociant l'adulte donneur de tubes séminifères, suivie par dépôt de cellules sur les départs constitués d'une ligne de cellules stromales testiculaire (JK1) ^3. Grâce passage en série, fortement adhérent, contaminant les cellules non germinales sont dépourvues de la culture à l'enrichissement concomitant des SSC. Cultures produites de cette manière contiennent un mélange de spermatogonies à différents stades de différenciation, qui contiennent des SSC, basée sur le long terme la capacité d'auto-renouvellement. Le point crucial de la méthode SESC est qu'il permet SSC pour rendre le passage difficile de l'auto-renouvellement in vivo à long terme d'auto-renouvellement in vitro dans un micro-environnement radicalement différent, produit à long terme des lignes SSC, libre de contaminationcellules somatiques, et permet ainsi une manipulation expérimentale subséquente des SSC.

Protocol

1. Préparation de cellules nourricières Notez que tous les réactifs décrits ci-dessous doivent être préparés de manière stérile (voir les tableaux 1 et 2). Ce protocole utilise la lignée cellulaire JK1 (Cell Biolabs, Inc, catalogue # ABC-315) que les mangeoires qui est un dérivé de transformer des cellules adultes de souris somatiques testiculaires et a été décrit ailleurs 3. Notez également que toutes les procédures sur les animaux…

Representative Results

L'apparition de passage à zéro de type sauvage, adultes colonies SSC après 7 jours est illustré à la figure 1. Tridimensionnelles colonies sont constituées d'une couche de cellules plates fixées à des dispositifs d'alimentation ou de la matrice extracellulaire subalterne déposés par les dispositifs d'alimentation avec des couches multiples de SSC croissance sur le dessus. Bien SSC sains sont brillamment réfringente et uniformément de 11 à 12 um de diamètre, les bordures de …

Discussion

Cette méthode pour dériver SSC adultes utilisant des cellules nourricières testicule adulte dérivés est robuste et a réussi quand communs origines génétiques (par exemple FVB, C57BL6 et 129SV/C57Bl/6 mixte) et différentes souches mutantes ont été utilisées ^2,3,7,14. En fait, le micro-environnement créé par le système de culture est suffisante pour surmonter certains des obstacles génétiques au maintien SSC adultes di vivo (par exemple dans le cas de PLZF <s…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.