Seriell Anrikning av spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) i Kultur för Härledning av långfristiga SSC vuxen mus Lines

Summary

En enkel metod för att härleda och bibehålla spermatogoniala stam och progenitor cellinjer från vuxna möss presenteras här. Metoden utnyttjar matarceller ursprung från den somatiska cellavdelningen av vuxen mus testiklar. Denna teknik kan tillämpas på vanliga musstammar, inklusive transgena, knock-out, och knock-i möss.

Abstract

Spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) av testiklarna representerar ett klassiskt exempel av vuxna däggdjur stamceller och bevara fertiliteten för nästan livstid djuret. Medan de exakta mekanismerna som styr självförnyelse och differentiering in vivo utmanande att studien har olika system utvecklats tidigare för att sprida murina SSC in vitro med hjälp av en kombination av specialiserade odlingsmedier och celler feeder ^1-3.

De flesta in vitro plundringståg in biologi SSC har härledda cellinjer från nyfödda, eventuellt på grund av svårigheten att erhålla vuxna cellinjer ^4. Emellertid fortsätter testiklarna att mogna fram ~ 5 veckors ålder i de flesta musstammar. I början postnatala perioden, dramatiska förändringar i arkitekturen av testiklar och biologi både somatiska och spermatogenescykler celler, inklusive förändringar i uttrycksnivåer av många stamceller-relateradegener. Därför kan neonatally-härledda SSC linjer inte helt rekapitulera biologi vuxna SSC som kvarstår efter den vuxna testikeln har nått ett stabilt tillstånd.

Flera faktorer har hindrat produktionen av vuxna SSC linjer historiskt. Först, kan andelen av funktionella stamceller minskar under vuxenlivet, antingen på grund av inre eller yttre faktorer ^5,6. Dessutom, som med andra vuxna stamceller, har det varit svårt att berika SSC tillräckligt från totala vuxna testikelceller utan att använda en kombination av immunoselektion eller andra strategier sortering ^7. Vanligen använda strategier innefattar användning av kryptorchida möss som en källa för donatorceller på grund av en högre förhållande av stamceller till andra celltyper ^8. Baserat på hypotesen att borttagande av somatiska celler från den ursprungliga kulturen stör interaktion med stamceller nisch som är väsentliga för SSC överlevnad, utvecklade vi tidigare metoder för att härleda Vuxen Lines som inte kräver immunoselektion eller kryptorchida givare utan använder seriell anrikning av SSC: er i kultur, nedan kallade SESC ^2,3.

Metoden som beskrivs nedan innebär ett enkelt förfarande för att härleda vuxna SSC linjer genom dissociering vuxen donator sädeskanalerna, följt av utstrykning av celler på matare består av en testikel stromal cellinje (JK1) ^3. Genom seriepassage, starkt vidhäftande, kontaminerande icke-könsceller töms från kulturen med samtidig anrikning av SSC: er. Kulturer som produceras på detta sätt innehåller en blandning av spermatogonier i olika stadier av differentiering, som innehåller SSC, baserat på långsiktiga självförnyelse förmåga. Den springande punkten i SESC metoden är att den möjliggör SSC att göra den svåra övergången från självförnyelse in vivo till långsiktig självförnyelse in vitro i ett radikalt annorlunda mikromiljö, producerar långa SSC linjer, fri från förorenandesomatiska celler, och därigenom möjliggör efterföljande experimentell manipulation av SSC: er.

Protocol

1. Framställning av matarceller Observera att alla reagenser som beskrivs nedan bör förberedas i sterilt sätt (se tabell 1 och 2). Detta protokoll använder JK1 cellinjen (cell Biolabs, Inc., katalog # CBA-315) som matare som är en transformerad derivat av vuxen mus testikulära somatiska celler och har beskrivits på annat håll 3. Notera också att alla djurförsök bör utföras i enlighet med de institutionella riktlinjer och regler. <o…

Representative Results

Utseendet av passagen noll vildtyp, är vuxna SSC kolonier efter 7 dagar som visas i figur 1. Tredimensionella kolonier består av ett skikt av platta celler fästa vid matare eller underhuggare extracellulär matris som deponerats av matarna med flera skikt av SSC: er som växer på toppen. Medan friska SSC är ljust ljusbrytande och likformigt 11-12 ^ m diameter, cellkanterna är svåra att särskilja och storleken av kolonierna kan vara mycket varierande, både inom brunn och mellan brunnar framstäl…

Discussion

Denna metod för att härleda vuxna SSC med vuxna testikel-härledda matarceller är robust och har lyckats när gemensamma genetiska bakgrund (t.ex. FVB, C57BL6 och blandade 129SV/C57Bl/6) och olika muterade stammar användes ^2,3,7,14. I själva verket är mikromiljön som skapas av den kultur-systemet tillräckligt för att övervinna några av de genetiska hinder för att upprätthålla vuxna SSC in vivo (t.ex. i fråga om plzf ^{– / –} djur) ^7. Medan vi använder JK1 c…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.