En enkel metod för att härleda och bibehålla spermatogoniala stam och progenitor cellinjer från vuxna möss presenteras här. Metoden utnyttjar matarceller ursprung från den somatiska cellavdelningen av vuxen mus testiklar. Denna teknik kan tillämpas på vanliga musstammar, inklusive transgena, knock-out, och knock-i möss.
Spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) av testiklarna representerar ett klassiskt exempel av vuxna däggdjur stamceller och bevara fertiliteten för nästan livstid djuret. Medan de exakta mekanismerna som styr självförnyelse och differentiering in vivo utmanande att studien har olika system utvecklats tidigare för att sprida murina SSC in vitro med hjälp av en kombination av specialiserade odlingsmedier och celler feeder 1-3.
De flesta in vitro plundringståg in biologi SSC har härledda cellinjer från nyfödda, eventuellt på grund av svårigheten att erhålla vuxna cellinjer 4. Emellertid fortsätter testiklarna att mogna fram ~ 5 veckors ålder i de flesta musstammar. I början postnatala perioden, dramatiska förändringar i arkitekturen av testiklar och biologi både somatiska och spermatogenescykler celler, inklusive förändringar i uttrycksnivåer av många stamceller-relateradegener. Därför kan neonatally-härledda SSC linjer inte helt rekapitulera biologi vuxna SSC som kvarstår efter den vuxna testikeln har nått ett stabilt tillstånd.
Flera faktorer har hindrat produktionen av vuxna SSC linjer historiskt. Först, kan andelen av funktionella stamceller minskar under vuxenlivet, antingen på grund av inre eller yttre faktorer 5,6. Dessutom, som med andra vuxna stamceller, har det varit svårt att berika SSC tillräckligt från totala vuxna testikelceller utan att använda en kombination av immunoselektion eller andra strategier sortering 7. Vanligen använda strategier innefattar användning av kryptorchida möss som en källa för donatorceller på grund av en högre förhållande av stamceller till andra celltyper 8. Baserat på hypotesen att borttagande av somatiska celler från den ursprungliga kulturen stör interaktion med stamceller nisch som är väsentliga för SSC överlevnad, utvecklade vi tidigare metoder för att härleda Vuxen Lines som inte kräver immunoselektion eller kryptorchida givare utan använder seriell anrikning av SSC: er i kultur, nedan kallade SESC 2,3.
Metoden som beskrivs nedan innebär ett enkelt förfarande för att härleda vuxna SSC linjer genom dissociering vuxen donator sädeskanalerna, följt av utstrykning av celler på matare består av en testikel stromal cellinje (JK1) 3. Genom seriepassage, starkt vidhäftande, kontaminerande icke-könsceller töms från kulturen med samtidig anrikning av SSC: er. Kulturer som produceras på detta sätt innehåller en blandning av spermatogonier i olika stadier av differentiering, som innehåller SSC, baserat på långsiktiga självförnyelse förmåga. Den springande punkten i SESC metoden är att den möjliggör SSC att göra den svåra övergången från självförnyelse in vivo till långsiktig självförnyelse in vitro i ett radikalt annorlunda mikromiljö, producerar långa SSC linjer, fri från förorenandesomatiska celler, och därigenom möjliggör efterföljande experimentell manipulation av SSC: er.
Denna metod för att härleda vuxna SSC med vuxna testikel-härledda matarceller är robust och har lyckats när gemensamma genetiska bakgrund (t.ex. FVB, C57BL6 och blandade 129SV/C57Bl/6) och olika muterade stammar användes 2,3,7,14. I själva verket är mikromiljön som skapas av den kultur-systemet tillräckligt för att övervinna några av de genetiska hinder för att upprätthålla vuxna SSC in vivo (t.ex. i fråga om plzf – / – djur) 7. Medan vi använder JK1 c…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av New York State Department of Health (C026878). MS var en New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Delvis stöd i forskningsbidrag nr 5-FY11-571 från March of Dimes Foundation.
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
Table 2. Dissociation buffer | |||
StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
Additional supplements** | |||
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
Table 3. Stem cell medium | |||
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |