यहाँ हम ऊतक इंजीनियरिंग के लिए अलग परतों के बीच निरंतर इंटरफेस के साथ biocompatible, स्तरित matrices बनाने के लिए एक अद्वितीय रणनीति का वर्णन. इस तरह के एक पाड़ एक आदर्श अनुकूलन वातावरण प्रदान करने के लिए विभिन्न जैविक, रासायनिक या यांत्रिक संकेत सेल व्यवहार ठीक कर सकता है
Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9.
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.
DGMP multilayered जैल है कि महंगे उपकरण पर भरोसा नहीं करता है के लिए तैयारी करने के लिए एक सरल रणनीति है. इस प्रोटोकॉल कोलाजेन और hyaluronic एसिड के रूप में अन्य biocompatible सामग्री का उपयोग scaffolds बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Bioactive छोटे अणुओं, उदाहरण के लिए कोशिका आसंजन Rgds पेप्टाइड बढ़ावा देने, बहुलक मैट्रिक्स को सीमित किया जा सकता है परतों के बीच संकेत के मिश्रण को रोकने के. प्रोटीन रासायनिक विकार के लिए आवश्यकता के बिना अलग परतों में समझाया जा सकता क्योंकि वे, मैट्रिक्स जाल आकार पर निर्भर करता है, कम करने के लिए 10 hydrogels के माध्यम से फैलाना प्रवण हैं. यहाँ हम (Nycoprep) iodixanol, एक आभ्यांतरिक घनत्व आपरिवर्तक है, जो पहले व्यवहार्य सेल अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है. Sucrose और dextrose रूप में अन्य घनत्व संशोधक भी इस्तेमाल किया जा सकता है. व्यवस्थित समय (टी एस) द्वारा अलग, एक दो परतों के बीच इंटरफेस चिकनी या तेज बदलाव के रूप में की जरूरत है (लंबे समय तक व्यवस्थित समय निर्बाध संक्रमण देता है) ठीक धुन कर सकते हैं <> 10 समर्थन. उदाहरण के लिए, DGMP जेल परतों के बीच चिकनी संक्रमण chemotaxis के रूप में सेल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक जैविक क्यू के एक सतत ढाल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
जेल कठोरता पर घनत्व आपरिवर्तक का प्रभाव एक 15% aPEGda जेल के लिए चित्रा 5 में दिखाया गया है, और PEGda और iodixanol सांद्रता के एक समारोह के रूप में कठोरता और porosity के एक अधिक संपूर्ण लक्षण वर्णन वर्तमान में मूल्यांकन किया जा रहा है. जबकि इस उदाहरण में PEGda एकाग्रता अपेक्षाकृत अधिक है, हम 30% iodixanol के साथ जैल में बिना जैल की तुलना में 60% अधिक लोचदार मापांक मनाया. modulating macromer एकाग्रता या crosslinking घनत्व के द्वारा जेल कठोरता में परिवर्तन के लिए समायोजित किया जा सकता है.
हम भी DGMP के लिए 3 डी multilayered polyacrylamide और खूंटी 10 व्यापारियों का उपयोग जैल बनाने के लिए तकनीक का आवेदन किया है. एकाग्रता या prepolymer की crosslinking की डिग्री परिवर्तनीय में संरचनात्मक बदलाव की अनुमति देता हैscaffolds, जो सेल polarized और 3 डी में विकास प्रवास के रूप में इस तरह के व्यवहार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
सारांश में, DGMP एक अनुकूलनीय तकनीक है कि बायोमेडिकल और बुनियादी अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए एक व्यापक रेंज biocompatible सामग्री की एक किस्म से 2 डी और 3 डी scaffolds निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों NIH निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार (1DP2 OD006499 01 ए.ए. और 1DP2 Aje OD006460-01) से समर्थन है, और विज्ञान और प्रौद्योगिकी (यूसी Nanomedicine में उत्कृष्टता के सैन डिएगो केंद्र) के लिए राजा अब्दुलअ सिटी के लिए आभारी हैं. हम पांडुलिपि पर उसके आलोचकों की टिप्पणियों के लिए सुश्री जेसिका मूर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
MALDI | Bruker | N/A |
UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
VersaDoc | Bio-Rad | N/A |