Den reversible tilsætning af palmitat til proteiner er en vigtig regulator af intracellulært protein trafficking. Dette er af særlig interesse i neuroner, hvor mange synaptiske proteiner palmitoylated. Vi anvender en enkel biokemisk metode til at påvise palmitoylated proteiner i dyrkede neuroner, som kan tilpasses til flere celletyper og væv.
Palmitoylering er en posttranslationel lipid modifikation involverer fastgørelsen af en 16-carbon-mættede fedtsyre, palmitat, at cysteinrester af substratproteiner via en labil thioesterbinding [revideret i 1]. Palmitoylering af et substrat-protein øger dets hydrofobicitet, og typisk letter handel mod cellulære membraner. Nylige undersøgelser har vist, palmitoylering at være en af de mest almindelige lipid modifikationer i neuroner 1, 2, hvilket antyder, at palmitat omsætningen er en vigtig mekanisme, ved hvilken disse celler regulerer målretning af og handel med proteiner. Den identifikation og detektion af palmitoylated substrater kan derfor bedre vores forståelse af protein handel med neuroner.
Påvisning af protein palmitoylering tidligere er blevet teknisk hindret på grund af manglen på en konsensussekvens blandt substratproteiner, og afhængigheden af metaboliske labeling palmitoyl-proteiner med 3H-palmitat, en tidskrævende biokemisk assay med lav følsomhed. Udvikling af Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay muliggør hurtigere og høj følsomhed påvisning af palmitoylated proteiner 2-4, og er optimalt for måling af dynamisk omsætning palmitat på neuronale proteiner. The ABE assay består af tre biokemiske trin (figur 1): 1) irreversibel blokering af umodificerede cystein-thiolgrupper med N-ethylmaliemide (NEM), 2) specifik spaltning og demaskering af palmitoyleret cystein er thiolgruppe af hydroxylamin (HAM), og 3) selektiv mærkning af palmitoyleret cystein under anvendelse af en thiol-reaktiv biotinyleringsreagens, biotin-BMCC. Oprensning af de thiol-biotinylerede proteiner efter de ABE skridt er forskelligt, afhængigt af det overordnede mål for forsøget.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til oprensning af en palmitoyleret protein af interesse i primære hippocampal neuroner efter en første immunpræcipitering (IP) under anvendelse af et antistof rettet mod proteinet, efterfulgt af ABE assay og western blotting for direkte at måle palmitoylering niveauer af dette protein, som betegnes den IP-ABE assay. Low-density kulturer af embryonale rotte hippocampus neuroner er ofte blevet brugt til at studere lokalisering, funktion og handel med neuronale proteiner, hvilket gør dem særdeles velegnede til at studere neuronal protein palmitoylation ved hjælp af IP-ABE assay. IP-ABE assay hovedsageligt kræver standard IP og western blotting-reagenser, og er kun begrænset af tilgængeligheden af antistoffer mod målsubstratet. Dette assay kan let tilpasses til oprensning og påvisning af transficerede palmitoylated proteiner i heterologe cellekulturer, primære neuronale kulturer afledt fra forskellige hjernevæv af både mus og rotter, og selv primært hjernevæv selv.
IP-ABE assay præsenteret her er en enkel og meget følsom fremgangsmåde til påvisning palmitoylated proteiner i dyrkede primære hippocampale neuroner ved anvendelse meste standard biokemiske teknikker. Dette gør analysen let at tilpasse til laboratorier, der allerede er udstyret med vestlige blotting materialer. IP-ABE assay kombinerer en standard immunoprecipitation protokol til at isolere og immobilisere ens målprotein efterfulgt af tidligere beskrevet ABE kemi 2-4 til hurtigt at detektere niveauer af palmitat på et substrat-protein. Den ABE teknik har en bred vifte af applikationer til at undersøge palmitoylated proteiner i forskellige væv og cellelinier, herunder storstilet palmitoyl-proteomisk screening af globale palmitoylering profiler, og hurtig detektion af palmitoylering niveauer af et enkelt mål protein.
Tidligere beskrivelser af ABE kemi har anvendt forskellige metoder cellelyse og detergentekstraktion af neuronal proteins 2, 9, fri thiol-blokade 10, 11, biotinylering, og oprensning af målproteinet 4, afhængigt af anvendelsen af forsøget. Tilsætningen af palmitat til neuronale proteiner resulterer i deres målretning mod cellulære membraner, og detektion af palmitoyleret del af et målprotein vil kræve dets ekstraktion fra disse membraner. Tidligere beskrevne ABE metoder har anvendt en række ionisk 9 og ikke-ioniske detergenter 8 at ekstrahere ønskede målproteiner, og anvendelsen af en bestemt detergent afhænger af målproteinet og dets kendte membran handel. Her udnytter vi den ikke-denaturerende og ikke-ionisk detergent IGEPAL CA-630 for at udtrække palmitoylated proteiner, som vi har valideret til udvinding og påvisning af palmitoyleret neuronal protein δ-catenin (figur 2). Strukturen af IGEPAL CA-630 omfatter en voluminøs og stiv ikke-polære hovedgruppe, som ikkeforstyrre native protein konformation eller interaktioner, men som giver sit samarbejde med de hydrofobe regioner membran-associerede proteiner, og dermed gav blandbarhed til dem og tillader deres udvinding. Mange neuronale proteiner lokaliseret i den synaptiske membran eller postsynaptisk tæthed af synapser skal ekstraheres ved hjælp IGEPAL CA-630, men nogle kan ikke fuldstændigt opløseliggøres, og kan kræve anvendelse af et andet ikke-denaturerende detergent såsom Triton X-100, som har er tidligere blevet anvendt til ABE kemi 2, 8.
Flere beskrivelser af ABE kemi har også anvendt et andet thiol-reaktive biotinyleringsreagens fra molekylet denne beskrivelse, kaldet Biotin-HPDP (Thermo Scientific), hvilket nødvendiggør også en anden metode til proteinrensning 4. Biotin-HPDP er et andet thiol-reaktiv, maliemide-konjugeret biotin-molekyle, der indeholder en disulfidbinding i maliemide linkerarm, strukturelt differentiating det fra biotin-BMCC, som ikke indeholder denne disulfidbinding. Efter thiol-biotinylering af et proteins fri eller palmitoyleret cystein med Biotin-HPDP, kan den resulterende disulfidbinding mellem målproteinet og biotin-gruppen spaltes ved reduktion reagenser til frigivelse biotingruppen og regenerere proteinet i dets umodificerede form, hvilket gør biotinylering af Biotin-HPDP forbigående og reversible. Derfor er brugen af dette biotinyleringsreagens kræver oprensning af et målprotein ved immobiliseret avidin reagenser, såsom streptavidin-belagte kugler. Imidlertid thiol-biotinylering af et målprotein ved biotin-BMCC, som er beskrevet her, er stabile og relativt permanent, og kræver rensning af målproteinet med et antistof rettet mod målet, og immobiliseret på sepharoseperler. Begge ABE teknikker er tidligere blevet anvendt til store skærme, og påvisning af palmitoylering af enkelte proteiner 2, 8-10, 12, ogIP-ABE assay vi beskriver her er optimal til hurtig påvisning af palmitoylation af enkelte neuronale målproteiner.
Et overvældende flertal af cellulær palmitoylation involverer reversible tilsætning af palmitat til thiolgruppen af cysteiner (betegnet S-palmitoylation, som vi generaliserer som 'palmitoylation' i denne protokol), er imidlertid en meget begrænset gruppe af proteiner udsat for irreversibel palmitoylation på glycin og cysteinrester ved dannelsen af stabile amidbindinger, betegnet N-palmitoylering 13. En begrænsning ved ABE kemi er den manglende evne til at detektere N-palmitoylering grund af stabiliteten af amidbindingen og således screening af et hidtil ukendt målprotein for palmitoylering bør bekræftes ved anvendelse af 3H-palmitat metabolisk mærkning 1.
Som tidligere nævnt kan IP-ABE assay let tilpasses til undersøgelse palmitoylering i proteinekstrakter fra flere kilder, herunder transfected heterologe cellelinjer, primære væv og primære neuronale kulturer fra forskellige hjerneområder. IP-ABE assay er blevet anvendt til at undersøge palmitoylering tilstrækkeligheden af muterede cystein-til-serin-proteiner for at identificere placeringen af en palmitoyleret cystein langs et målprotein 8, for at behandle dynamisk palmitat omsætning på synaptiske proteiner i dyrkede neuroner under basale betingelser 10, og ændringer i palmitoylering niveauer af neuronale proteiner efter induktion af neuronal aktivitet 9. Følsomheden og tilpasningsevne IP-ABE assay gør det ideelt til at undersøge palmitoylering profiler af neuronale proteiner, og optimal til detektering dynamiske ændringer i palmitoylation.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra canadiske Institutes of Health Research MOP-81.158.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
PMSF | Fluka | 93482 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche Complete Mini | 11 836 153 001 | |
NEM | Sigma | E3876 | |
HAM solution | Sigma | 46780-4 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Ensure compatibility with chosen detergent |
Protein G/A-coated sepharose beads | GE Healthcare | 17-6002-35 | |
Biotin-BMCC | Thermo Scientific | 21900 | |
Streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21126 | Reconstitute at 1 mg/ml in water |
Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 21059 |