Den reversible tilsetning av palmitate til proteiner er en viktig regulator av intracellulær protein menneskehandel. Dette er av spesiell interesse i nevroner hvor mange synaptiske proteiner palmitoylated. Vi benytter en enkel biokjemisk metode for å detektere palmitoylated proteiner i dyrkede nevroner, som kan tilpasses for flere celletyper og vev.
Palmitoylation er en post-translasjonell modifikasjon lipid involverer festing av en 16-karbon mettet fettsyre, palmitat, til cysteinrester av substrat proteiner gjennom en labil thioester obligasjon [gjennomgått i en]. Palmitoylation av et substrat protein øker dens hydrofobisitet, og vanligvis letter dens menneskehandel mot cellulære membraner. Nyere studier har vist palmitoylation å være en av de vanligste lipid endringer i en nevroner, 2, noe som tyder på at palmitat omsetning er en viktig mekanisme for disse cellene regulerer målretting og trafficking av proteiner. Identifisering og gjenkjenning av palmitoylated underlag kan derfor bedre vår forståelse av protein trafficking i nerveceller.
Påvisning av protein palmitoylation i fortiden har vært teknisk hindret grunnet mangel på en konsensus sekvens blant substrat proteiner, og avhengigheten metabolske labeling av palmitoyl-proteiner med 3 H-palmitat, en tidkrevende biokjemisk analysen med lav følsomhet. Utvikling av Acyl-Biotin Exchange (ABE) analysemedium muliggjør raskere og høy følsomhet påvisning av palmitoylated proteiner 2-4, og er optimal for å måle det dynamiske omsetning palmitate på neuronmembraner proteiner. ABE-analysen består av tre biokjemiske trinn (figur 1): 1) irreversible blokade av umodifiserte cystein tiolgrupper bruker N-ethylmaliemide (NEM), 2) spesifikke spalting og avslørt av palmitoylated cystein er tiolgruppe av hydroksylamin (HAM), og 3) selektiv merking av palmitoylated cystein ved hjelp av en tiol-reaktiv biotinylation reagens, biotin-BMCC. Rensing av tiol-biotinylerte proteiner etter de ABE trinnene har forskjellig, avhengig av den generelle formålet med forsøket.
Her beskriver vi en fremgangsmåte for å rense en palmitoylated protein av interesse i primær hippocampal nevroner etter en innledende immunoutfelling (IP) trinn med et antistoff rettet mot proteinet, etterfulgt av ABE analysen og Western blotting å direkte måle palmitoylation nivåer av at protein, som er betegnet IP-ABE analysen. Low-density kulturer av embryonale rotte hippocampus nevroner har vært mye brukt for å studere lokalisering, funksjon og trafficking av nevrale proteiner, noe som gjør dem ideelt egnet for å studere neuronal protein palmitoylation bruker IP-ABE analysen. IP-ABE analysen krever hovedsakelig standard IP og vestlige blotting reagenser, og er kun begrenset av tilgangen på antistoffer mot målet underlaget. Denne analysen kan lett tilpasses for rensing og detektering av transfekterte palmitoylated proteiner i heterologe cellekulturer, primære nevronale kulturer avledet fra ulike hjernen vev av både mus og rotter, og selv primær hjernevev selv.
IP-ABE assay presentert her er en enkel og svært sensitiv metode for å påvise palmitoylated proteiner i dyrkede primære hippocampus nevroner, bruker hovedsakelig standard biokjemiske teknikker. Dette gjør analysen lett tilpasses for laboratorier allerede utstyrt med Western blotting materialer. IP-ABE assay kombinerer en standard immunoutfelling protokoll til å isolere og immobilisere ens målprotein, etterfulgt av tidligere beskrevet ABE kjemi 2-4 til raskt detektere nivåer av palmitat på et substrat protein. ABE teknikken har et bredt spekter av applikasjoner for behandlingen palmitoylated proteiner i forskjellige vev og cellelinjer, inkludert storskala palmitoyl-proteomikk screening av globale palmitoylation profiler, og rask påvisning av palmitoylation nivåer av en enkelt målproteinet.
Tidligere beskrivelser av ABE kjemi har utnyttet ulike metoder cellelyse og vaskemiddel utvinning av neuronal prot2 Eins, 9, frie tiol-blokade 10, 11, biotinylation, og rensing av målproteinet 4, avhengig av applikasjonen av eksperimentet. Tilsetningen av palmitate til nevronale proteiner resulterer i deres målrettingen mot cellulære membraner, og påvisning av palmitoylated brøkdel av et målprotein vil kreve sin ekstraksjon fra disse membranene. Tidligere beskrevne ABE metoder har brukt en rekke ionisk 9 og ikke-ioniske vaskemidler 8 å trekke ønskede target proteiner, og bruken av en spesiell vaskemiddel avhenger målprotein og kjent membran menneskehandel. Her utnytter vi ikke-denaturerende og ikke-ionisk detergent IGEPAL CA-630 til å trekke ut palmitoylated proteiner, som vi har validert for utvinning og påvisning av det palmitoylated neuronal proteinekstravasasjon δ-catenin (Figur 2). Strukturen av IGEPAL CA-630 inneholder en klumpete og stivt ikke-polart hodegruppe som ikkeforstyrre innfødte protein konformasjon eller interaksjoner, men som muliggjør tilknytning til hydrofobe regioner av membran-assosierte proteiner, og dermed overdrar blandbarhet til dem og tillater deres utvinning. Mange neuronale proteiner lokalisert til den synaptiske membran eller postsynaptiske tetthet av synapser bør utvides ved å bruke IGEPAL CA-630, men noen kan ikke helt solubilisere, og kan kreve bruk av en annen ikke-denaturerende vaskemiddel som Triton X-100, som har tidligere brukt til ABE 2 kjemi, 8.
Flere beskrivelser av ABE kjemi har også anvendt et forskjellig tiol-reaktivt biotinylation reagens fra molekylet vi beskriver her, kalt Biotin-HPDP (Thermo Scientific), som også nødvendiggjør en annen metode for proteinrensing 4. Biotin-HPDP er en annen tiol-reaktiv maliemide-konjugert biotin molekyl som inneholder en disulfidbinding i maliemide linkerarm, strukturelt differentiating det fra Biotin-BMCC, som ikke inneholder denne disulfidbinding. Etter tiol-biotinylation av et protein gratis eller palmitoylated cystein Biotin-HPDP, kan den resulterende disulfidbinding mellom målproteinet og biotin gruppen bli spaltet ved å redusere reagenser å frigjøre biotin gruppen og regenerere proteinet i sin umodifiserte form, noe som gjør biotinylation av Biotin-HPDP forbigående og reversible. Derfor kan bruk av denne biotinylation reagens trenger rensing av et målprotein etter immobiliserte avidin reagenser, for eksempel streptavidin-belagte perler. Imidlertid, tiol-biotinylation av et målprotein fra Biotin-BMCC, som vi beskriver her, er stabil og relativt permanent, og krever rensing av målproteinet ved et antistoff rettet mot målet, og immobilisert på Sepharose-kuler. Begge ABE teknikker er tidligere benyttet for storskala skjermer, og påvisning av palmitoylation av single proteiner 2, 8-10, 12, og denIP-ABE analysen vi beskriver her er optimal for rask påvisning av palmitoylation av enkle nevrale target proteiner.
Et overveldende flertall av mobilnettet palmitoylation innebærer reversible tillegg av palmitate til tiolgruppe av cysteinene (kalt S-palmitoylation, som vi generalisere som "palmitoylation" i denne protokollen), er imidlertid en svært begrenset gruppe av proteiner utsatt for irreversibel palmitoylation på glysin og cysteinrester gjennom dannelsen av stabile amidbindinger, betegnet N-palmitoylation 13. En begrensning ABE kjemi er dens manglende evne til å påvise N-palmitoylation grunn av stabiliteten i amidbinding, og så screening av en roman målprotein for palmitoylation bør bekreftes ved hjelp av 3H-palmitat metabolsk merking 1.
Som tidligere nevnt, kan IP-ABE analysen lett tilpasses for behandlingen palmitoylation i proteinekstrakter fra flere kilder, inkludert transfected heterologe cellelinjer, primær vev, og primære neuronal kulturer fra flere områder av hjernen. IP-ABE analysen har vært benyttet for å undersøke palmitoylation tilstrekkelighet av muterte cystein-til-serin proteiner for å identifisere plasseringen av en palmitoylated cystein langs et mål protein 8, for å undersøke dynamiske palmitate omsetning på synaptiske proteiner i dyrkede nerveceller i henhold basale forhold 10, og endringer i palmitoylation nivåer av nevronale proteiner etter induksjon av neuronal aktivitet 9. Følsomheten og tilpasningsevne av IP-ABE analysen gjør den ideell for å undersøke palmitoylation profiler av neuronal proteiner, og optimal for å oppdage dynamiske endringer i palmitoylation.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra kanadiske Institutes of Health Research MOP-81158.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
PMSF | Fluka | 93482 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche Complete Mini | 11 836 153 001 | |
NEM | Sigma | E3876 | |
HAM solution | Sigma | 46780-4 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Ensure compatibility with chosen detergent |
Protein G/A-coated sepharose beads | GE Healthcare | 17-6002-35 | |
Biotin-BMCC | Thermo Scientific | 21900 | |
Streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21126 | Reconstitute at 1 mg/ml in water |
Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 21059 |